電穿孔轉(zhuǎn)化感受態(tài) E.coli TG1 細胞的制備
原理
主要原理就是通過處理使細胞的通透性變大,直觀的說,使得細胞膜表面出現(xiàn)一些孔洞,便于外源基因或載體進入感受態(tài)細胞。由于細胞膜的流動性,這種孔洞會被細胞自身所修復(fù)。
材料與儀器
TG1細胞
NaCl 胰化蛋白胨 酵母提取物 去離子水 KCl NaOH 葡萄糖溶液 MgCl2 甘油
恒溫旋轉(zhuǎn)式搖床 三角燒瓶 離心管 低溫高速離心機
步驟
一、試劑配制
SB培養(yǎng)基
細菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨 20g
細菌培養(yǎng)用酵母提取物 5g
NaCl 0.5g
去離子水 950ml
250mmol/L KCl溶液 10ml
二、操作步驟
1. 從新鮮的LB平板培養(yǎng)物中挑選一個TG1克隆,接種于10ml SB培養(yǎng)基中。
2. 37℃搖床培養(yǎng)過夜。
3. 取2.5ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于0.5L SB中,另添加10ml 20%葡萄糖和5ml 1mol/L MgCl2。
4. 37℃培養(yǎng)直到OD600=0.7~0.8。
5. 將培養(yǎng)物置于冰浴15min,然后4000r/min于4℃離心20min,棄上清。
6. 將菌體重懸于1/2體積的預(yù)冷10%甘油中,4000r/min于4℃離心20min,棄上清。
7. 重復(fù)第(6)步驟。
8. 將菌體重懸于15ml 10%甘油,并轉(zhuǎn)移至一支50ml的離心管中。3500r/min于4℃離心15min。小心地去掉上清,得到4~5ml細菌。迅速地將其吹打重懸;
9. 分裝成200μl或40μl 的小份,操作應(yīng)在乙醇/干冰浴中進行。貯存于-70℃。
10. 用pUC19質(zhì)粒測試制備感受態(tài)細菌的轉(zhuǎn)化效率,應(yīng)達到109cfu/μg DNA。
注意事項
1. 挑選低代數(shù)的菌種是關(guān)鍵,千萬不要每次活化后保存活化后的菌種,更不要將菌種長期保存在-20度。
2. 大腸桿菌在平板上過夜生長后,可置冰箱中保存一個月左右;接種新鮮的菌落或菌液有利于細菌細胞的同步快速生長,從而使細菌群體在達到一定的OD值后(0.375)大部分細胞都處于感受態(tài)。
3.?大腸桿菌的生長需要氧氣,劇烈振蕩的目的是提高培養(yǎng)基的溶氧量以利于細菌的生長。
4.?達到細菌對數(shù)生長早、中期,需時約2.0~2.5小時,此步驟至為關(guān)鍵,若超過此階段,則轉(zhuǎn)化效率急劇下降。
5.?低溫操作的目的是使細胞不再生長,保持其感受態(tài)。
6.?洗滌細胞時細胞較脆弱,懸浮沉淀時動作要輕,可用移液槍輕輕吸打。
7. -80℃冰箱儲存的感受態(tài)細胞在6-8周后,轉(zhuǎn)化率很快降低??捎靡灰阎獦?biāo)準(zhǔn)及濃度的閉環(huán)質(zhì)粒如pUC18/19鑒定感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化能力。
常見問題
來源《工業(yè)微生物實驗技術(shù)手冊》