豬甲狀腺細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

原理

由于甲狀腺富含纖維性組織，所以甲狀腺的消化分離一般采用膠原酶與胰蛋白酶聯(lián)合消化法，用單一的胰蛋白酶消化效果一般；促甲狀腺激素(TSH)是培養(yǎng)甲狀腺細(xì)胞必備的，它能夠起到促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞生長的作用。

材料與儀器

豬甲狀腺
F-12培養(yǎng)基 胎牛血清 胰蛋白酶 膠原酶Ⅳ 牛 TSH
眼科剪 滴管 離心機(jī) 培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱

步驟

一、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 殺豬后迅速取出甲狀腺 1～2 個(gè)，置于盛有 75%酒精的燒杯中，用冰盒送至實(shí)驗(yàn)室(1 h 以內(nèi))。

2. 立即置于pH為7.4 的PBS緩沖液(含青鏈霉素)中，反復(fù)漂洗，直至漂洗液清澈透明。

3. 去除包膜及結(jié)締組織，用眼科剪子、鑷子將甲狀腺組織剪成1mm3 大小的碎塊。

4. 置含0.25%胰酶和300 U/ml 膠原酶的容器中，放于 37℃溫箱中消化60 min，每隔15min 需搖動(dòng)一次。

5. 用吸管將上清液的三分之二吸入離心管中，并加入含有胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。

6. 以1000  rpm 離心10分鐘后，棄上清。

7. 將細(xì)胞沉淀用F-12 培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，充分吹打并用不銹鋼網(wǎng)(200目)過濾，再以1000 rpm 離心10分鐘，棄上清。

8. 沉淀懸于含15% 胎牛血清和1 U/L牛 TSH的F-12 培養(yǎng)基中，臺(tái)盼藍(lán)染色證明活細(xì)胞數(shù)大于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度接種于培養(yǎng)板中(1 ml/孔)。

9. 置于 37℃的5% CO2 孵箱中，每 2-3 天換液一次，至細(xì)胞融合成片后用于實(shí)驗(yàn)。

二、結(jié)果
豬甲狀腺細(xì)胞培養(yǎng) 24 小時(shí)，鏡下細(xì)胞貼壁，呈聚集生長，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，如下圖。

    圖 1  培養(yǎng) 24 小時(shí)后的豬甲狀腺細(xì)胞

注意事項(xiàng)

1. 原代培養(yǎng)時(shí)，接種的細(xì)胞活性的好壞直接關(guān)系到培養(yǎng)的成敗。

2. 組織熱缺血時(shí)間短的組織的細(xì)胞活性好。取材后盡量不要耽擱時(shí)間，宜盡快處理并培養(yǎng)。

3. 對(duì)于僅為單純獨(dú)立的甲狀腺腺瘤而質(zhì)地較軟的組織，因相對(duì)容易消化，消化時(shí)間可以適當(dāng)縮短。

4. 鏡下觀察接種到培養(yǎng)瓶中的原代細(xì)胞，若大部分為5～10個(gè)相連的細(xì)胞小團(tuán)，就最容易生長。

常見問題

胰蛋白酶適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織如上皮組織、肝、腎等，對(duì)傳代細(xì)胞也非常好。

但消化纖維性組織或較硬的癌組織則效果較差。膠原酶對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用，適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織等。

由于甲狀腺富含纖維性組織，所以甲狀腺的消化分離一般采用膠原酶與胰蛋白酶聯(lián)合消化法，用單一的胰蛋白酶消化效果一般；促甲狀腺激素(TSH)是培養(yǎng)甲狀腺細(xì)胞必備的，它能夠起到促進(jìn)甲狀腺細(xì)胞生長的作用。