植物組織中游離氨基酸總量的測(cè)定

簡(jiǎn)介

氨基酸 (amino acid) 是組成蛋白質(zhì)的基本單位，也是蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物。植物根 系吸收和同化的氮素主要以氨基酸和酰胺的形式進(jìn)行運(yùn)輸。所以測(cè)定植物組織中不同時(shí)期、 不同部位游離氨基酸的含量，對(duì)于研究根系生理、氮素代謝等有一定意義。本實(shí)驗(yàn)的目的是 掌握站三酮顯色法測(cè)定氨基酸含量的原理和方法。

原理

植物組織中游離氨基酸總量的測(cè)定的基本原理是氨基酸的游離氨基與水合站三酮反應(yīng) (如下)。首先，氨基酸脫氨脫歿被氧化，水 合帯三酮被還原成還原型站三酮。接著，還原型弗三酮與另一個(gè)氧化型帶三酮分子和氨縮合 生成藍(lán)紫色化合物，稱為 Ruhemans 紫。其吸收峰為 570 nm, 且在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺 與氨基酸的含量成正比。據(jù)此，可用分光光度計(jì)在波長(zhǎng) 570 nm 下測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度值, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算岀未知樣品中氨基酸的總量。脯氨酸與站三酮反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，需另行測(cè)定。

材料與儀器

材料：各種植物組織。

器材：分光光度計(jì)，恒溫水浴，天平，容量瓶，漏斗，三角瓶，研缽，具塞刻度試管，移液 管等。

試劑：

(1) 水合站三酮試劑：稱取 0.6 g 再結(jié)晶的茹三酮置于燒杯中，加入 15 mL 正丙醇，攪拌 使其溶解。再加入 30 mL 正丁醇及 60 mL 乙二醇，最后加入 9 mL pH 5.4 的乙酸-乙酸鈉緩 沖液，混勻，貯于棕色瓶中，置冰箱中保存?zhèn)溆茫?0 天內(nèi)有效。

(2)pH 5. 4 乙酸-乙酸鈉緩沖液：稱取結(jié)晶乙酸鈉 54. 4 g, 加 100 mL 無(wú)氨蒸餡水，在電爐 上加熱至沸，使體積蒸發(fā)至原體積的一半。冷卻后加 30 mL 冰乙酸，用無(wú)氨蒸循水定容至 100 mL。

(3) 標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液：稱取 80C 下烘干的亮氨酸 46.8 mg, 溶于少量 10% 異丙醇中，用 10% 異丙醇定容至 100 mL。取此液 5 mL, 用無(wú)氨蒸個(gè)水稀釋至 50 mL, 即為含氮 5 昭- mL1 的標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液。

(4)0. 1% 抗壞血酸：稱取 50 mg 抗壞血酸溶于無(wú)氨蒸餡水中，并定容至 50 mL, 隨用 隨配。

(5)10% 乙酸：用無(wú)氨蒸餡水配制，按 V/V 計(jì)。

步驟

植物組織中游離氨基酸總量的測(cè)定的基本過程可分為如下幾步：

1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取 6 支 20 mL 具塞刻度試管，編號(hào)，按表 51-1 添加試劑?；靹颍w上玻 塞，置沸水浴中加熱 15 min, 然后取出放在冷水浴中迅速冷卻并經(jīng)常搖動(dòng)，使加熱時(shí)形成的紅 色逐漸被空氣氧化而褪色，直至溶液呈藍(lán)紫色時(shí)，加 5 mL 無(wú)氨蒸餡水，混勻，用光徑 1 cm 的 比色杯，在波長(zhǎng) 570 nm 下測(cè)定其吸光度值。以氨基態(tài)氮量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪 制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表 51-1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作加樣表

2. 樣品提取: 取新鮮植物樣品，洗凈、擦干并剪碎、混勻后，迅速稱取 0.5?1.0 g, 于研缽 中加入 5 mL 10% 乙酸，研磨成勻漿后，用無(wú)氨蒸餡水定容至 100 mL, 搖勻，上清液用干濾紙 過濾到三角瓶中備用。

3 . 樣品測(cè)定：吸取上清液 1 mL, 放入 20 mL 具塞刻度試管中，加無(wú)氨蒸餡水 1 mL, 其他 步驟與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線操作相同，測(cè)定樣品液的吸光度值，根據(jù)吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣 品液的含氮量。

4. 結(jié)果計(jì)算:

C X V

游離氨基酸含量 (mg?100 g-】FW) = w x ] 00()X100

式中：C 一為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的含氮量屮 g；

V 一樣品液總體積?mL；

W■-樣品重?go

注意事項(xiàng)

1. 合格的站三酮應(yīng)該是微黃色結(jié)晶，若保管不當(dāng)，則顏色加深或變成微紅色，必須重結(jié)晶 后方可使用。其方法如下：5 g 站三酮溶于 15 mL 熱蒸餡水中，加入 0.25 g 活性炭，輕輕搖 動(dòng)，溶液太稠時(shí)，可適量加水，30 min 后用濾紙過濾，濾液置冰箱中過夜后即可見微黃色結(jié)晶 析出，用干濾紙過濾，再用 1 mL 蒸饞水洗結(jié)晶一次，置于干燥器中干燥后貯于棕色瓶中。

2. 氨基酸與站三酮反應(yīng)十分靈敏，需用無(wú)氨蒸憎水。

3. 所生成的顏色在 1 h 內(nèi)保持穩(wěn)定，稀釋后應(yīng)抓緊時(shí)間比色，用水稀釋反應(yīng)生成物時(shí)，須 在 0.5 h 內(nèi)測(cè)完。

4. 由于空氣中氧干擾顏色反應(yīng)，以抗壞血酸為還原劑，可提高反應(yīng)的靈敏度并使顏色穩(wěn) 定, 但由于抗壞血酸也可與茄三酮反應(yīng)，使溶液顯色過深, 故應(yīng)嚴(yán)格掌握加入抗壞血酸的量。

5. 反應(yīng)時(shí)的溫度影響顯色的穩(wěn)定性，在沸水浴中加熱溫度超過 80°C, 溶液易褪色。在 80°C 水浴中加熱，適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間會(huì)獲得良好的效果。