正常及腎衰家兔磺胺嘧啶鈉藥動學參數的測定實驗

原理

血中磺胺類藥物能與某些試劑發生反應，生成有色物質，通過比色對磺胺血濃度進行定量。根據用藥后不同時間血中藥物濃度的變化規律，計算血漿半衰期及其它藥動學參數。通過注射氯化汞復制急性腎衰的動物模型，比較正常及腎衰家兔內生肌酐清除率的不同以及藥動學參數的差別，以達到將生理、藥理和病理生理的知識有機融合之目的。
碘胺類藥物生成有色物質的反應如下：一、重氮化：磺胺與亞硝酸反應，生成重氮鹽，因亞硝酸易分解，無現成制劑，所以實驗中用亞硝酸鈉，使其與鹽酸反應生成亞硝酸，磺胺也必須首先與鹽酸反應，使其苯核上的氨基（-NH2）離子化生成銨類（-NH3+）化合物才能與亞硝酸發生重氮化反應。
具體反應如下：
1. NaNO2+HCl→HNO2+NaCl

偶聯反應：鹽酸重氮苯磺胺與麝香草酚在堿性溶液中發生偶聯反應生成橙黃色的偶氮化合物。

材料與儀器

家兔
磺胺嘧啶鈉三氯醋酸亞硝酸鈉麝香草酚氫氧化鈉鹽酸磺胺嘧啶鈉肝素氯化汞烏拉坦氯化鈉普魯卡因肝素鈉溶液肌酐標準應用液苦味酸氫氧化鈉碳酸鈉碳酸氫鈉
試管吸管加樣器注射器采血杯吸球棉球 722 型分光光度計離心機恒溫水浴離心管手術器械

步驟

一、復制腎衰模型
實驗前一天（18～20 h），取家兔（狀態佳者）2 只，稱重后一只皮下注射 1%HgCl2 溶液 1.2 ml/kg 體重，造成急性腎功能衰竭動物模型；另 1 只則在相同部位注射等量的生理鹽水作為正常對照。

二、收集尿液
1.  注射葡萄糖：分別取上述兩兔稱重，用烏拉坦 5 ml/kg 腹腔注射麻醉。固定于兔臺上，耳緣靜脈注射 5％葡萄糖溶液 15 ml/kg 體重(5 min 內注完)，以保證有足夠的尿量。
2.  膀胱插管：腹部剪毛，在恥骨聯合上 l.5 cm 處作腹正中切口，長約 4 cm。分離皮下組織。沿腹白線切開腹膜，找到膀胱，作膀胱插管，先排空剩余尿液，然后收集 l h 尿液，并換算成每分鐘排尿量。

三、采集血樣
1. 頸動脈插管：將家兔背位固定于兔臺上，剪去前頸部的毛，沿正中線由甲狀軟骨向下將頸部皮膚切開約 5 厘米。用血管鉗鈍性剝離皮下組織，分開肌肉，游離位于氣管側方的一側頸總動脈，將其同周圍組織以及伴行的神經分離。為了防止動脈插管內凝血，在手術進行到此時，從耳靜脈注射 1% 肝素約 1 ml/kg。然后，將頸總動脈頭側端結扎，心側端用動脈夾夾住。在二者中間穿線打虛結，用眼科小剪刀在近頭側部結扎處向下剪一小口，向頸動脈內插入充滿肝素的三通管。結扎并加以固定。
2.  采集正常血液：從三通管放血約 0.5 ml，搖勻，備測藥動學參數之用；另取 3 ml左右血液備測肌酐清除率之用。
3.  向家兔一側耳緣靜脈內快速注入 20％磺胺嘧啶鈉１ ml/kg。
4.  在用藥后第 1、3、5、15、30、60、90、120 分鐘時，分別從連接頸動脈的三通管采血約 0.5 ml、搖勻（應先放掉動脈插管內的殘血）。

四、內生肌酐清除率測定
血、尿肌酐測定方法(見下表 5-2)和內生肌酐清除率的計算。將尿樣稀釋：將尿液充分混合后，取出 1 ml 尿液，用蒸餾水將其稀釋 100 倍，以備測定尿中肌酐含量。
將血樣離心：將 3 ml 血液放入離心機中，3000 r/min，離心 20 分鐘，取出血漿備用。按下表加藥：

4. 混勻，置 37 ℃水浴 20 min，再放到冷水盆中轉動 1 min 使冷卻。在 520 nm 波長處各以其相應的空白管調零，比色測定標準管和測定管的光密度。
5. 計算血中肌酐含量：

6. 注意事項
（1）血清、標準液等試劑量應準確。
（2）煮沸及冷卻時間宜準確．否則顏色反應消退。
（3）所需試劑宜在使用前兩周內配制，逾期則苦味酸顏色加深，光密度值隨之增高。影響檢測結果。此時需做試劑空白較正。方法如下(表 5-3)：

以 B0 為空白，測定 B 管的光密度。新配的試荊空白光密度在 0.01 左右。依下式計算：

（4）公式中的 0.23 為血漿中蛋白質含量在正常范圍的蛋白干擾系數，若血漿蛋白質含量過高或過低，則宜采用傳統的無蛋白濾液測定法。
（5）苦味酸具有爆炸性。配制時應先在容器內加少許蒸餾水，以防意外。

五、磺胺嘧啶鈉藥動學參數的測定
1.  脫蛋白：準確吸取各血樣 0.2 ml，分別加入蒸餾水 1.8 ml（標準管 1.6 ml），５％三氯醋酸 4.0 ml，搖勻后將液體放入離心管中進行離心：1000 r/min，3 分鐘。
2.  重氮化及偶聯呈色：分別吸取不同時間的離心后的上清液 2.0 ml 加入對應的試管中，并依次向各試管中加入下述試劑：
2N 鹽酸 0.5 ml.
0.5％亞硝酸鈉 0.5 ml.
0.5％麝香草酚 1.0 ml，搖勻。
3.  標準管的處理：同其他樣品管所不同的是，需要準確加入 30mg％的磺胺嘧啶鈉0.2 ml，以保證計算結果的準確性。
4.  比色：將各管內藥液分別置于 722 型分光光度計的 0.5 cm 比色杯內，在波長為480 nm 處比色，以給藥前的樣品管調零點，測出各樣品管的光密度值。記錄：

6. 計算：
（1）在其它條件（波長、比色杯、吸收系數、溶液稀釋倍數等）一致的情況下，同一種溶液濃度與光密度成正比，故可用下述公式求出樣品管的磺胺血濃度（mg%）。

（2）作圖：將上述計算好的各時間的血樣濃度換算成對數濃度，在方格紙上對時間做圖，找出消除相和分布相之間的拐點。
（3）用殘數法計算磺嘧啶鈉的藥動學參數。
①用計算器對拐點后的消除相各時間及相應的血濃度進行直線回歸，求出直線的截距 a 和斜率 b；進而求出 B=10a，β=-2.303b（若為一房室，β為Ｋ）；根據 t1/2 =0.693/β,求出消除相半衰期 tl/2；最后寫出消除相的經時方程 Ct=B·e-βt。
②根據 Ct=B·e-βt 計算各個時間的血藥濃度。
③計算分布相的血藥濃度：用拐點前實際測得的各血藥濃度，減去其對應時間的消除相的血藥濃度，其差值即為分布相的血藥濃度。用該濃度的對數對時間進行直線回歸，
可求得 logA，α，進一步求出 A、tl/2、和分布相的經時方程 C t = Ae-αt。
④寫出磺胺嘧啶鈉在體內的總經時方程：C=Ae-αt ＋B·e-βt。依該方程計算各時間的理論血濃度值，可比較與實測值的差別。
⑤依藥動學的公式計算磺胺嘧啶鈉在家兔體內的各種動力學參數。