染色質免疫沉淀
簡介
染色質免疫沉淀法（chromatin immunoprecipitation，ChIP）是研究體內蛋白質與DNA相互作用的一種技術。
真核生物的基因組DNA以染色質的形式存在，研究蛋白質與DNA在染色質環(huán)境下的相互作用是闡明真核生物基因表達機制的基本途徑。
ChIP利用抗原抗體反應的特異性，可以靈敏地檢測目標蛋白與特異DNA片段的結合情況，是目前確定與特定蛋白結合的基因組區(qū)域、與特定基因組區(qū)域結合的蛋白質的最好方法。
ChIP常用于研究轉錄因子（transcription factor，TF）與啟動子（promoter）相互結合，研究組蛋白（Histone）的各種共價修飾與基因表達的關系等。
染色質免疫沉淀技術一般包括細胞固定，染色質斷裂，染色質免疫沉淀，交聯(lián)反應的逆轉，DNA的純化，以及DNA的鑒定。
原理
染色質免疫沉淀的基本原理是在生理狀態(tài)下把細胞內的DNA與蛋白質交聯(lián)、固定在一起，通過超聲或酶處理將染色質隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段。
用所要研究的目的蛋白特異性的抗體沉淀這種交聯(lián)復合體，特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。
用途
染色質免疫沉淀常用于研究轉錄因子（transcription factor，TF）與啟動子（promoter）相互結合，研究組蛋白（Histone）的各種共價修飾與基因表達的關系等。
材料與儀器
器材：
①靜音混合器
②高速低溫離心機
③超聲破碎儀
④電泳儀、水平電泳槽
⑤PCR儀
⑥Real-time PCR儀
試劑：
①材料：HeLa細胞
②HEPES
③NaCl、KOH、HCl、Triton X-100、NP-40、SDS、NaHCO3
④去氧膽酸鈉、EDTA、Tris
⑤蛋白酶抑制劑、蛋白酶 K、Protein A／Gbeads（鮭精DNA）
⑥對照引物（GAPDH）
⑦陽性對照抗體［乙酰化組蛋白H3抗體（Anti-Acetyl HistoneH3）］、陰性對照抗體［正常家兔IgG（Normal IgG）］
⑧瓊脂糖
⑨PCR反應 Mix、SYBR Green qPCR Mix
步驟
基本過程可分為如下幾步：
（一）試劑配制
（1）裂解（FA Lysis）緩沖液 50 mmol／L HEPES-KOH,pH 7.5;140 mmol/L NaCl; 1 mmol/L EDTA, pH 8.0；1％ Triton X-100；0.1％ 去氧膽酸鈉；0.1％ SDS；蛋白酶抑制劑（臨用前加入）。
（2）RIPA緩沖液 50 mmol／L Tris-HCI，pH 8.0； 150 mmol/L NaCl；2 mmol/L EDTA,pH 8.0;1% NP- 40；0.5％ 去氧膽酸鈉；0.1％ SDS；蛋白酶抑制劑（臨用前加入）。
（3）漂洗（Wash）緩沖液 0.1％ SDS；1％ TritonX-100;2 mmol/L EDTA，pH 8.0;150 mmol/L NaCl; 20 mmol/L Tris-HCI，pH 8.0。
（4）最終漂洗（Final Wash）緩沖液 0.1％ SDS；1% Triton X-100;2 mmol/L EDTA,pH 8.0;500 mmol/L NaCl;20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0。
（二）細胞固定
（1）取一平皿細胞（150 mm平皿），細胞匯合度約80％～90％（HeLa細胞約1x107個），平皿中含有培養(yǎng)基20 ml，加入550 μl 37％ 甲醛（或1100 μl 18.5％ 甲醛），使甲醛的終濃度為1％。
（2）溫和混勻，室溫孵育10 min。
（3）終止交聯(lián)：加甘氨酸至終濃度為125 mmol／L，溫和混勻，室溫孵育5 min。
（4）將平皿置于冰上。
（5）吸盡培養(yǎng)基，用20 ml冰冷的PBS清洗細胞。
（6）吸盡PBS，重復清洗細胞1次。
（7）加入2 ml冰冷的PBS（含有1x蛋白酶抑制劑復合物），用細胞刮刀收集細胞，于1.5 ml離心管中。
（8）1000 g、4 ℃，離心5 min。
（9）吸去上清液，加入750 μl FA Lysis緩沖液，重懸細胞，得到細胞裂解液。
（三）染色質斷裂
（1）將裝有細胞裂解液的離心管置于冰上，進行超聲破碎，超聲功率為310 W，20 s沖擊，2 s間隙，超聲3次（根據(jù)不同的細胞株，不同的細胞數(shù)量超聲的條件不同，需實驗摸索），超聲探頭要盡量深入管中，但不接觸管底或側壁，以免產生泡沫。
（2）超聲破碎后，10000 g、4 ℃，離心10 min，去除細胞碎片等不溶物質。
（3）吸取上清液分裝至新1.5 ml離心管中，每管50 μl（可于-80 ℃保存3個月）。
（4）可取100 μl超聲破碎后產物，加入5 μl蛋白酶K（20 mg／ml），65 ℃，旋轉混合，解交聯(lián)4～5 h（或過夜），分出一半用酚-氯仿抽提，1.5 ％ 瓊脂糖電泳檢測超聲效果。
（四）染色質免疫沉淀
（1）在每管50 μl超聲破碎產物中加入450 μl RIPA緩沖液，為1：10比例稀釋，留取5 μl（1％ 體積）作為Input對照，4 ℃保存至第4步操作（1）。
（2）加入抗體：每管樣品中分別加入陽性對照抗體、陰性對照抗體（正常IgG）及目的蛋白抗體，抗體用量為1～10 μg。根據(jù)抗體效價、純度及特異性，梯度稀釋抗體，實驗確定抗體用量。
（3）加入20 μl充分混勻的 Protein A／G beads（Salmon Sperm DNA）。
（4）4 ℃，旋轉混合，1 h或過夜。
（5）2000 g，離心1 min，棄去上清液。
（6）清洗beads 3次，每次用1 ml Wash緩沖液，2000 g離心1 min，棄去上清液。
（7）清洗beads 1次，用1 ml Final Wash緩沖液，2000 g離心1 min，棄去上清液。
（五）解交聯(lián)反應和DNA的純化
用蛋白酶K，65 ℃保溫4～5 h解交聯(lián)，經(jīng)DNA純化柱回收DNA或用酚-氯仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。
（1）每份樣品中均加入120 μl Elution 緩沖液（包括Input對照組），30 ℃，旋轉混合，15 min。
（2）2000 g離心1 min。
（3）吸取上清液至一新的離心管中，可于-20 ℃保存。
（4）加入5 μl蛋白酶K（20 mg／ml），65 ℃，旋轉混勻，解交聯(lián)4～5 h（或過夜）。
（5）DNA用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，加100 μl水溶解DNA，可于-20 ℃保存。
（六）DNA的鑒定
最常用的DNA鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR。
（七）實驗結果及分析
（1）交聯(lián)后的染色質經(jīng)超聲波斷裂，2％ 瓊脂糖凝膠電泳分析結果，打斷后的染色質片段的平均長度應該在200～1000 bp左右。
（2）純化后得到的DNA片段經(jīng)PCR分析，擴增片段為管家基因GAPDH的啟動子區(qū)，片段大小165 bp，陽性對照和Input對照可見擴增產物，無DNA模板PCR對照無擴增產物，陰性對照可見微弱擴增條帶，但與陽性對照比較差別明顯。
注意事項
（1）甲醛交聯(lián)反應時間根據(jù)細胞種類和細胞數(shù)量多少不同，需經(jīng)預實驗確定。
如果交聯(lián)時間過長，則實驗材料易丟失，且交聯(lián)后的DNA-蛋白質復合體難以用超聲打斷；交聯(lián)時間過短，則交聯(lián)不完全。
（2）超聲波是使用機械力斷裂染色質，容易引起升溫或產生泡沫，使蛋白質變性，影響ChIP的效率，在超聲波斷裂染色質時，要在冰上進行，且要設計時斷時續(xù)的超聲程序，超聲時間也不要太長，以免蛋白降解。
（3）在做ChIP實驗時，要做好實驗對照，如果沒有對照，很難對實驗結果的可靠性進行評估。陽性抗體和陰性抗體對照是最基本的實驗對照。
同時要做好Input對照，Input對照不僅可以驗證染色質斷裂的效果，還可以根據(jù)Input中的靶序列的含量以及染色質沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率。
（4）染色質免疫沉淀所用目的蛋白抗體的選擇是ChIP實驗成功的關鍵。因為在蛋白質與染色質交聯(lián)結合時，抗體的抗原表位可能因為與結合位點的距離太近，不能被抗體識別。
所以不能有效地在體內形成免疫沉淀復合物，直接影響ChIP的結果，因此不是所有的抗體都能做ChIP實驗的，只有經(jīng)過ChIP實驗驗證后的抗體才能確保實驗結果的可靠性。
