細胞免疫共沉淀實驗（Co-IP）

原理

其原理是如果細胞內兩蛋白（A、B）有直接或間接的相互作用時，那么在溫和的裂解條件下獲得的蛋白樣品中加入 A 蛋白的抗體將 A 蛋白沉淀下來，在細胞內與 A 蛋白直接相互作用的 B 蛋白或與其間接相互作用的 C 蛋白能一起被沉淀下來。

使用western blot檢測沉淀中是否存在 B 或 C 蛋白來確定 B 或 C 蛋白與 A 蛋白的相互作用。

用途

1.檢測 A、B 蛋白在體內是否相互結合

2.分離與 A 蛋白相互作用的蛋白復合物

材料與儀器

【樣品和試劑】

293T 細胞（以該細胞做轉染為例）、轉染質粒（Flag-A，HA-B) 、flag 抗體、2Ⅹ loading buffer、PBS、Flag-beads、1X TBST、5X SDS loading buffer、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑 A 和 B、RIPA 裂解液；

【實驗儀器】

磁力架、金屬浴、RIPA 裂解液旋轉混合儀、WB 實驗相關設備。

步驟

一、細胞的鋪板與轉染

1、提前一晚將 293T 細胞鋪板至 6 cm 皿中，鋪板量以達到相應的轉染試劑要求為準；

2、用各實驗室相應的轉染試劑將以下質粒組合轉染 2 皿細胞：flag 空載+HA-B；flag-A+HA-B；每質粒 2 微克。

二、免疫沉淀

1、轉染 24 小時后，收獲細胞，每皿加入 500 μL 裂解液，收集細胞至1.5 mL EP 管中，在冰上超聲破碎細胞；

2、超聲好后，4℃，12,000 g，離心 30 分鐘，取 400 μL 上清液用于免疫沉淀，80 μL 上清用作總蛋白并加入等體積的 2Ⅹ loading buffer；

3、將 400 μL 上清加入用裂解液清洗了 3 遍的 beads 中，加入0.3-0.5 μg flag 抗體，4℃ 孵育 3-4 小時；

4、4℃，2,000 g，離心 3 分鐘，去除未結合的液體，留下 beads 沉淀，用預冷的蛋白裂解液清洗沉淀 3 次，每次 5 分鐘；

5、最后一次去除清洗液，往沉淀中加入 60 μL 2Ⅹ loading buffer，和總蛋白一起在沸水中煮沸 15 分鐘。

三、Western Blot 檢測

1、通過 SDS-PAGE 分離樣品，利用全蛋白樣品作為對照，檢測 flag-A 和 HA-B 蛋白是否發生結合。

注意事項

1.對于內源的 Co-IP 檢測應該用 10 cm 皿來培養目的細胞，并維持較好的生長狀態；

2.如果該實驗用于新蛋白的鑒定，應注意抗體重鏈和輕鏈的影響；

3.該實驗不能確定蛋白之間的相互作用是直接還是間接的。

常見問題

1、陰性有較強的條帶

這有可能是結合較弱或清洗不干凈導致的

2、內源的 Co-IP 實驗結合較弱或者不結合

可能是蛋白表達較弱，建議做過表達的 Co-IP