免疫共沉淀技術

原理

以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法，是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。
其原理是：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質－蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。目前多用精制的prorein A預先結合固化在argarose的beads上，使之與含有抗原的溶液及抗體反應后，beads上的prorein A就能吸附抗原達到精制的目的。這種方法常用于測定兩種目標蛋白質是否在體內結合；也可用于確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。

材料與儀器

蛋白質
RIPA Buffer PBS Protein A agarose 瓊脂糖 考馬斯亮藍染色液
離心機 搖床 EP管 細胞刮子 離心管 培養板 電泳儀 電泳槽 高效液相色譜儀

步驟

一、試劑準備

1.  預冷PBS，RIPA Buffer，細胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機。

2.  用預冷的PBS洗滌細胞兩次，最后一次吸干PBS。
3.  加入預冷的RIPA Buffer(1 ml/107個細胞、10 cm培養皿或150 cm2培養瓶，0.5 ml/5x106個細胞、6 cm培養皿、75 cm2培養瓶）。

4.  用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶上刮下，把懸液轉到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動15 min（EP管插冰上，置水平搖床上）。

5.  4℃，14000 g離心15 min，立即將上清轉移到一個新的離心管中。

6.  準備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。

7.   每1 ml總蛋白中加入100 ul Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10 min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景。

8.   4℃，14000 g離心1 5min，將上清轉移到一個新的離心管中，去除Protein A珠子。

9． （Bradford 法）做蛋白標準曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個月）。

10.  用PBS將總蛋白稀釋到約1 ug/ul，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細胞中含量較低，則總蛋白濃度應該稍高（如10 ug/ul）。

11.  加入一定體積的兔抗到500 ul總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細胞系中的多少而異。

12.  4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育。

13.  加入100 ul Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1 h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 ul "過渡抗體"（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG）。

14.  14000 rpm瞬時離心5 s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，去上清，用預冷的RIPA buffer洗3遍，800 ul/遍，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復合物內部的結合，可以使用PBS。

15.  用60 ul 2x上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據上樣多少的需要而定（60 ul足夠上三道）。

16.  將上樣樣品煮5 min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應再次煮5 min變性。

二、免疫共沉淀反應

1．  轉染后24-48 h 可收獲細胞，加入適量細胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min, 細胞裂解液于4°C，最大轉速離心30 min后取上清；

2． 取少量裂解液以備Western blot分析，剩余裂解液加1ug相應的抗體加入到細胞裂解液，4°C緩慢搖晃孵育過夜；

3． 取10 ul protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3 000 rpm離心3 min；

4.． 將預處理過的10 ul protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過夜的細胞裂解液中4°C緩慢搖晃孵育2-4 h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；

5． 免疫沉淀反應后，在4°C 以 3000 rpm 速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 ml裂解緩沖液洗3－4次；最后加入15 ul的2xSDS 上樣緩沖液，沸水煮5分鐘；

6． SDS-PAGE，Western blotting或質譜儀分析。
 

三、通過免疫共沉淀確定結合蛋白

1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中；

2．將每毫升細胞懸液轉移到微量離心管中，在微量離心機上4℃以最大速度離心15 ；
3．收集上清（約30 ml）并加入30 ug的適當抗體，4℃搖動免疫沉淀物1 h；

4．加入0.9 ml的蛋白質A-Sepharose 懸液，4℃搖動免疫沉淀物30 min；

5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復洗5次。最后，用NETN洗一次；

6．吸出混合物的液體部分。加入800 ul的1xSDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4 min；
7．將樣品加入到大孔的不連續SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恒定電流下電泳過夜；

8．通過考馬斯亮藍染色觀察蛋白質泳帶；

9．從膠上切下目標帶，將其放到微量離心管中，用1 ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min；

10． 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質，再將肽電洗脫；

11． 通過窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機器上進行自動Edman降解測序。

注意事項

1.  細胞裂解采用溫和的裂解條件，不能破壞細胞內存在的所有蛋白質——蛋白質相互作用，多采用非離子變性劑（NP40 或Triton X-100）。每種細胞的裂解條件是不一樣的，通過經驗確定。不能用高濃度的變性劑（0.2％SDS），細胞裂解液中要加各種酶抑制劑，如商品化的。

2.  使用明確的抗體，可以將幾種抗體共同使用。

3.  使用對照抗體：

單克隆抗體：正常小鼠的IgG或另一類單抗

兔多克隆抗體：正常兔IgG

4.  確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的，而并非外源非特異蛋白，單克隆抗體的使用有助于避免污染的發生。

5.  要確保抗體的特異性，即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀。

6.  確定蛋白間的相互作用是發生在細胞中，而不是由于細胞的溶解才發生的，這需要進行蛋白質的定位來確定。

常見問題

一、免疫共沉淀的優點

1.  相互作用的蛋白質都是經翻譯后修飾的，處于天然狀態。
2.  蛋白的相互作用是在自然狀態下進行的，可以避免人為的影響。
3.  可以分離得到天然狀態的相互作用蛋白復合物。


二、免疫共沉淀的缺點

1.  可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質－蛋白質相互作用；
2.  兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；
3.  必須在實驗前預測目的蛋白是什么，以選擇最后檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。
 

三、RIPA Buffer配制

1.  基礎成分

Tris-HCl（緩沖液成分，防止蛋白變性）

NaCl（鹽份，防止非特異蛋白聚集）

NP-40（非離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲存液）

去氧膽酸鈉（離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲存液；避光保存）

注意：準備激酶（致活酶）實驗時，不要加去氧膽酸鈉，因為離子型去污劑能夠使酶變性，導致活性喪失。

2.  RIPA蛋白酶抑制劑

苯甲基磺酰氟（PMSF）（用異丙醇配制成200 mM的儲存液，室溫保存）

EDTA（鈣螯合劑；用H2O配制成100 mM的儲存液，PH 7.4）

亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1 mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存）

抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1 mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存）

胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）（用甲醇配制成1 mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存）

3.  RIPA磷酸（酯）酶抑制劑

激活的Na3VO4（用H2O配制成200 mM的儲存液

NaF（200 mM的儲存液，室溫保存）

注意：在準備做磷酸（酯）酶實驗的時候，不加磷酸酯酶抑制劑。
 

四、工作液配制

1.  配制100 ml的modified RIPA buffe

（1）稱取790 mg 的Tris-Base，加到75ml 去離子水中，加入900 mg的NaCl，攪拌，直到全部溶解，用HCl調節PH值到7.4。

（2）加10 ml 10%的NP-40。

（3）加2.5 ml 10%的去氧膽酸鈉，攪拌，直到溶液澄清。

（4）加1 ml 100mM的EDTA，用量筒定容到100 ml，2-8℃保存。

（5）理論上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制劑應該在使用當天同時加入（抑蛋白酶肽、亮抑酶肽、胃蛋白酶抑制劑各100 ul；PMSF、Na3VO4、 NaF各500 ul），但是PMSF在水溶液中很不穩定，30分鐘就會降解一半，所以PMSF應該在使用前現加，其他抑制劑成分可以在水溶液中穩定5天。