明膠酶譜實(shí)驗(yàn)
原理
細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是細(xì)胞生存的重要內(nèi)環(huán)境，不僅含有膠原、糖蛋白、蛋白多糖等成分，而且含有大量的蛋白酶、細(xì)胞因子、黏附分子。ECM，尤其是其中的基底膜，是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中必須克服的生理屏障。基質(zhì)金屬蛋白酶家族（MMPs）可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，幫助腫瘤細(xì)胞克服這一屏障
并為細(xì)胞增殖提供空間。MMP2、MMP9是主要降解基底膜上IV型膠原和明膠的基質(zhì)金屬蛋白酶類，與惡性腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系尤為密切，通過蛋白電泳即可檢測(cè)MMP2，MMP9的活性。
材料與儀器
細(xì)胞勻漿 組織提取物
聚丙烯酰胺凝膠 明膠 濃縮膠 Tris-甘氨酸緩沖液 Triton X-100 過硫酸銨 甲醇 醋酸 考馬斯亮藍(lán) 蛋白質(zhì)上樣緩沖液
電泳糟 pH計(jì) 凝膠成像儀 離心機(jī) 電泳儀 細(xì)胞培養(yǎng)瓶 倒置顯微鏡 超凈臺(tái) 高壓蒸汽滅菌鍋 電子天平 液氮罐 微型旋轉(zhuǎn)柱 旋轉(zhuǎn)混合儀
步驟
一、主要試劑的配制
1. 平衡緩沖液：50 mmol／L Tris（pH7.5），0.5 mol／L NaCl，10 mmol／L
CaCl2，0.01％Tween 20，5 mmol／L 鄰二氮菲。
2. 洗滌緩沖液1：50 mol／L Tris（pH7.5），0.5 mmoL／L NaCl，10 mmol／L CaCl2，0.05％Tween 20，5 mmol／L鄰二氮菲。
3. 洗滌緩沖液2：50 mmol／L Tris（pH7.5），10 mmoL／L CaCl2，0.01％Tween 20，5 mmol／L鄰二氮菲。
4. 8％分離膠（含0.1％明膠）：30％丙烯酰胺2.7 ml，ddH20 4.5 ml，1.5 mol／L Tris（pH 8.8）2.5 ml，10％ SDS 100 μl，10％ 過硫酸銨（APS） 100 μl，TEMED 6 μl。
5. 濃縮膠：ddH20 2.1 ml，30％丙烯酰胺0.5 ml，1 mol／L Tris-HCI（pH6.8）0.38 ml，10％SDS 30 μl，10％過硫酸銨30 μl，TEMED 3 μl。
6. 5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（pH8.3）：0.125 mol／L Tris-HCl，1.25 mol／L甘氨酸，0.5％SDS。
7. 5×上樣緩沖液：30％ 1 mol／L Tris-HCl（pH6.8），25％甘油，0.05％溴酚藍(lán)。
8. 洗脫液：2.5％ TritonX-100（去離子水定容）。
9. 孵育液：50 mmoL／L Tris-HCl，10 mmol／L CaCl2，1％ TritonX-100，
pH7.5，去離子水定容。
10. 染色液：0.25％考馬斯亮藍(lán)R-250，45％甲醇，10％乙酸。
11. 脫色液：30％甲醇，10％乙酸。
二、實(shí)驗(yàn)方法
1. 收集生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的癌細(xì)胞培養(yǎng)液。
2. 將500μl培養(yǎng)液，45μl明膠瓊脂糖顆粒（使用前混勻）和45μl平衡緩沖液混合均勻后加入微型旋轉(zhuǎn)柱中，于旋轉(zhuǎn)混合儀上平衡30min。
3. 用洗滌緩沖液1洗滌瓊脂糖顆粒，每次100μl洗滌3次，7000r/min離心除去洗滌緩沖液1。
4. 用100μl洗滌緩沖液2洗滌瓊脂糖顆粒1次，7000r/min離心除去洗滌緩沖液2。
5. 向微型旋轉(zhuǎn)柱中加入40μl的2x上樣緩沖液，7000r/min離心。將離心后的上樣緩沖液重新加入微型旋轉(zhuǎn)柱中，于12000r/min離心10s。
6. 采用8%分離膠在130V恒壓下電泳2.5h。
7. 用洗脫液在搖床上洗滌蛋白膠2次，各30min，除去膠中的SDS。
8. 37℃孵育蛋白膠24h，使MMP分解明膠。
9. 搖床上染色1h及脫色至條帶清晰。
10. 蛋白成像：用凝膠成像儀進(jìn)行拍照。
注意事項(xiàng)
1. 制備聚丙烯酰胺時(shí)應(yīng)注意排除氣泡。
2. 明膠酶譜的活性受鈣離子，鋅離子和pH值等因素的影響，因此緩沖液配制應(yīng)嚴(yán)格準(zhǔn)確，盡量用超純水，孵育溫度要控制好。
3. 為防止樣品中的酶變性失活，禁忌煮沸蛋白樣品，且上樣緩沖液中不能含β-巰基乙醇或DTT。
4. 孵育液的pH最好在7.5——7.6，復(fù)性的Triton放置時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)有絮狀物，所以實(shí)驗(yàn)時(shí)盡量使用新鮮配置的溶液。
5. 孵育的37℃不要在CO2培養(yǎng)箱中，因?yàn)闀?huì)改變孵育液的pH值，在普通孵箱即可。
6. 明膠要4℃保存，配好后1周內(nèi)使用。
常見問題
來源《腫瘤治療藥物體外模型研究方法》。
