琥珀酸脫氫酶及丙二酸的抑制作用實驗

原理

琥珀酸脫氫酶能使琥珀酸脫氫生成延胡索酸，并將脫下的氫交給受氫體。用甲烯藍作受氫體時，甲烯藍被氫還原生成無色的甲烯白。其反應如下：
琥珀酸+甲烯藍→延胡索酸+甲烯白+藍酸
丙二酸是琥珀酸脫氫酶競爭性抑制劑細菌量越多或脫氫酶活性越高甲烯藍脫色所需時間越短，因此，甲烯藍脫色所需時間的倒數可用來表示酶的活性或細菌生長的情況。

材料與儀器

大腸桿菌
琥珀酸鈉甲烯藍磷酸丙二酸溶液液體石蠟
試管吸量管電熱水浴鍋

步驟

（一）琥珀酸脫氫酶活力檢查
1. 在1支斜面菌種管中加入約5 ml，0.15 mol/L，pH7.3緩沖液，用玻璃棒刮下斜面上的菌體，振蕩，倒入離心管中，2500 r/ min離心5 min，傾出洗滌液，菌體再加入6 ml，0.15 mol/L，pH7.3磷酸緩沖液，振蕩，制成菌懸液待用。
2. 取兩支試管各加入1 ml 0.02 mol/L琥珀酸鈉溶液，1 ml，pH7.3，0.15 mol/L磷酸緩沖液，0.3 ml，0.001 mol/L甲烯藍溶液。在1支試管中加入1 ml菌懸液，另一支試管加入已煮沸5 min的菌懸液1 ml（冷卻后加入）作對照。混勻立即加入0.5～1 ml液體石蠟。
3. 將試管于37 ℃水浴恒溫反應，觀察記錄甲烯藍變色所需時間。

（二）丙二酸對琥珀酸脫氫酶的抑制作用
取3支試管編號，按下表加入試劑：
先在試管中加入琥珀酸鈉、丙二酸鈉、水、磷酸緩沖液、甲烯藍等試劑，混勻后，立即加入一層液體石蠟，于37 ℃恒溫反應，從加入液體石蠟開始記錄甲烯藍變白所需時間。