酸性磷酸酶活性測定

簡介

酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）廣泛存在于各種細(xì)胞中，在部分癌細(xì)胞中酸性磷酸酶往往會(huì)異常表達(dá)。以對(duì)硝基酚磷酸鈉作為酸性磷酸酶反應(yīng)底物，在堿性條件下能夠水解生成黃色的對(duì)硝基酚，通過比色測定即可對(duì) ACP 進(jìn)行定量分析。

用途

用以測定組織或細(xì)胞中 ACP 的水平。

材料與儀器

組織或細(xì)胞，RIPA（中弱）裂解液，對(duì)硝基酚磷酸鈉溶液，緩沖液

分光光度計(jì)，恒溫水浴鍋，剪刀，研缽，試管等

步驟

1. 取細(xì)胞沉淀或組織，加入 RIPA 裂解液，使用剪刀或研缽對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行充分裂解（置于冰上），將裂解液收集至離心管中，4 °C 下 15000 rpm 離心 15 min，收集上清液，此時(shí)上清液中包含酸性磷酸酶。

2. 加入緩沖液和對(duì)硝基酚磷酸鈉溶液。取少量上清液，加 ddH2O 進(jìn)行稀釋（稀釋約 5~10 倍），向陰性對(duì)照組（無酸性磷酸酶組）與測定酶活組加入的緩沖液與對(duì)硝基酚磷酸鈉溶液等量。混勻后，在 37 °C 恒溫水浴鍋中保溫反應(yīng) 10~15 min，每5min搖動(dòng)一次，反應(yīng)結(jié)束后，加入 0.5 M NaOH 溶液終止反應(yīng)。此時(shí) pH = 14，取 1 mL 液體在分光光度計(jì) 400 nm 下測試吸光度。

3. 酶活性（V：酶的體積，V1：每次用酶的體積）

注意事項(xiàng)

1. 反應(yīng)要在冰上進(jìn)行，全程保持低溫操作。

2. 提取得到的酶應(yīng)該立刻進(jìn)行反應(yīng)，保存于 -20 °C 也要盡快進(jìn)行試驗(yàn)。

3. 加入 NaOH 后，對(duì)硝基酚呈現(xiàn)黃色。