破骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)

簡(jiǎn)介

作為高度分化的多核巨細(xì)胞，破骨細(xì)胞主要來(lái)源于單核/巨噬細(xì)胞造血干細(xì)胞系，是一種具有骨吸收功能的細(xì)胞，目前研究破骨細(xì)胞分化的經(jīng)典細(xì)胞系包括小鼠 RAW264.7 單核巨噬細(xì)胞系與小鼠原代 BMMs 細(xì)胞系。

其中 RAW264.7 細(xì)胞是 Abelson 鼠白血病病毒誘導(dǎo) BALB/c 小鼠腫瘤生成后，收集小鼠腹水中單核樣巨噬細(xì)胞得到的細(xì)胞株，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)研究中。RAW264.7 細(xì)胞突破了原代單核巨噬細(xì)胞不能增殖傳代的限制，并且通過(guò) RANKL 誘導(dǎo)獲得的 RAW-OCs 骨吸收能力與 RANKL 誘導(dǎo) BMMs 分化形成的破骨細(xì)胞相似。

BMMs 屬于原代細(xì)胞，在體外培養(yǎng)過(guò)程需要額外添加 M-CSF 維持其存活，并且BMMs 不能傳代，但 BMMs 能夠更好的模擬人體內(nèi)破骨細(xì)胞的分化及骨分解功能。

原理

破骨細(xì)胞是分化后的終末細(xì)胞，沒(méi)有增殖分裂的能力，在體內(nèi)是單核巨噬細(xì)胞 BMMs 分化而來(lái)的。BMMs 細(xì)胞表面表達(dá) c-fms 和 RANK 受體，在細(xì)胞因子 M-CSF 和 RANKL 的作用下，單核巨噬細(xì)胞能夠增殖并啟動(dòng)分化。因此在體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞 RANKL 和 M-CSF 兩種細(xì)胞因子缺一不可，應(yīng)先提取 BMMs 并在培養(yǎng)基里添加 M-CSF 和 RANKL 從而啟動(dòng)細(xì)胞分化，獲得破骨細(xì)胞。

用途

用以模擬體內(nèi)破骨細(xì)胞分化過(guò)程，獲得破骨細(xì)胞后對(duì)藥物進(jìn)行篩選，探索分化前后細(xì)胞通路、基因水平、蛋白水平的變化情況。

圖源自：S. L. Teitelbaum, Science 2000, 289, 1504~1508.

材料與儀器

C57BL/6 小鼠（常用 4~8 周齡，雄性小鼠），alpha-MEM 培養(yǎng)基，雙抗

胎牛血清，手術(shù)器械，二氧化碳，培養(yǎng)皿，超凈臺(tái)，M-CSF 細(xì)胞因子

RANKL 細(xì)胞因子、TRAP 染液等

步驟

1. 使用二氧化碳窒息法將小鼠處死，并泡在 75% 乙醇中消毒 10 min。

2. 在動(dòng)物房超凈臺(tái)中將小鼠下肢的股骨與脛骨剝離，浸泡在 PBS 中。

3. 在細(xì)胞房超凈臺(tái)中，將股骨或脛骨兩端剪開(kāi)，刮凈骨外膜及其他附著組織，用 1 mL 注射器吸取 Alpha-MEM，輕輕的將針頭插進(jìn)骨的一端，輕柔的沖洗骨髓腔，反復(fù)三次直到骨髓腔變白并收集沖下來(lái)的培養(yǎng)基。

4. 室溫下 1000 rpm 離心 15 min，棄上清液，使用 Alpha-MEM 完全培養(yǎng)基（10% 胎牛血清+雙抗）重懸細(xì)胞沉淀，并鋪在兩個(gè) 10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12~24 小時(shí)。

5. 第二天棄除細(xì)胞上清液和不貼壁的細(xì)胞，使用 1000 μL 移液槍吸取 Alpha-MEM 完全培養(yǎng)基輕輕的反復(fù)吹打細(xì)胞培養(yǎng)皿底，將半貼壁細(xì)胞吹下并收集細(xì)胞懸液。

6. 室溫下使用離心機(jī) 1000 rpm 離心 5 min，棄除上清液，收集細(xì)胞沉淀，使用 Alpha-MEM 完全培養(yǎng)基（添加 30 ng/mL M-CSF）重懸細(xì)胞，并將其進(jìn)行鋪板（以 96 孔板為例），每孔鋪 8000 細(xì)胞，放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12~24 小時(shí)，直至多數(shù)細(xì)胞貼壁。

7. 將 96 孔板中原培養(yǎng)基移除，更換新鮮配置的 Alpha-MEM 完全培養(yǎng)基（30 ng/mL M-CSF 和 30 ng/mL RANKL），放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中，每 48 小時(shí)換液一次，每次換液培養(yǎng)基中均需要新鮮配置額外添加 M-CSF 與 RANKL 的 Alpha-MEM 完全培養(yǎng)基。

8. 約 3 天后，可在光鏡下發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)多核細(xì)胞，5~6天 后在顯微鏡下可以觀察到出現(xiàn)了大量具有明顯褶皺邊緣，多核的「巨大」細(xì)胞，使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色法對(duì)破骨細(xì)胞特異表達(dá)的 TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）進(jìn)行染色，被染色成紫紅色，且多核的細(xì)胞即為分化成功的破骨細(xì)胞。

注意事項(xiàng)

提取骨髓內(nèi)細(xì)胞時(shí)動(dòng)作必須輕柔。在提取當(dāng)天培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)可以添加 M-CSF 也可以不添加。M-CSF 和 RANKL 細(xì)胞因子要盡量選擇質(zhì)量好的試劑公司提供的產(chǎn)品，并保存在 -80 °C。

常見(jiàn)問(wèn)題

1. 提取細(xì)胞后第二天細(xì)胞培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁并非污染，而是紅細(xì)胞不貼壁導(dǎo)致的，只需要將上清液和不貼壁的細(xì)胞移除即可，但動(dòng)作要輕，不然半貼壁的 BMMs 也會(huì)有損失。

2. 破骨細(xì)胞一般在添加 RANKL 后的第 5~6 天大量出現(xiàn)，此時(shí)就應(yīng)該對(duì)細(xì)胞進(jìn)行 TRAP 染色并鑒定，7~8 天之后，破骨細(xì)胞會(huì)大量死亡。

參考來(lái)源：

1. Boyle, W.J., Simonet, W.S. & Lacey, D.L. Osteoclast differentiation and activation[J]. Nature, 2003; 423：337~342.

2. Teitelbaum, S.L. Bone resorption by osteoclasts[J]. Science,2000;289：1504~1508.