質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法

原理

感受態(tài)細(xì)胞易于接受外來基因成為重組細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)將質(zhì)粒加入有感受態(tài)細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，熱擊處理進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。

材料與儀器

細(xì)胞株 質(zhì)粒
鏈霉素 青霉素 FCS PBS 胰酶 EDTA 轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectamine TM2000) 胰化蛋白胨 酵母提取物 瓊脂 NaCl NaOH 氨芐青霉素 卡那霉素 質(zhì)粒提取試劑盒
高壓滅菌鍋 42℃恒溫水浴鍋 恒溫?fù)u床 無菌培養(yǎng)板 消毒1.5ml離心管 消毒槍頭 無菌操作臺(tái)

步驟

一、轉(zhuǎn)染

1. 從-70℃ 冰箱中取 200μl 感受態(tài)細(xì)胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。

2. 加入質(zhì)粒 DNA 溶液（含量不超過 50ng，體積不超過 10μl），輕輕搖勻，冰上放置 30 分鐘后。

3.42℃ 水浴中熱擊 45s/90s，熱擊后迅速置于冰上冷卻 3-5 分鐘。

4. 向管中加入 1 mlLB 液體培養(yǎng)基（不含 Amp），混勻后 37℃ 振蕩培養(yǎng) 1 小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因（Ampr）。

5. 將上述菌液搖勻后取 100μl 涂布于含 Amp 的篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37℃ 培養(yǎng) 16-24 小時(shí)。

6.在轉(zhuǎn)染的同時(shí)應(yīng)做兩個(gè)對(duì)照：

對(duì)照組 1：以同體積的無菌雙蒸水代替 DNA 溶液，其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的 LB 平板上應(yīng)沒有菌落出現(xiàn)。

對(duì)照組 2：以同體積的無菌雙蒸水代替 DNA 溶液，但涂板時(shí)只取 5μl 菌液涂布于不含抗生素的 LB 平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。

二、轉(zhuǎn)染大腸桿菌的擴(kuò)增

1. 從 LB 平板上挑取新活化的單個(gè)菌落，接種于 3-5 mlLB 液體培養(yǎng)基中，37℃ 下振蕩培養(yǎng) 12 小時(shí)左右，直至對(duì)數(shù)生長后期。將該菌懸液以 1：100-1：50 的比例接種于 100 mlLB 液體培養(yǎng)基中，37℃ 振蕩培養(yǎng) 2-3 小時(shí)至 OD600＝0.5 左右。

2. 取上述培養(yǎng)液置于冰中 10 min，之后轉(zhuǎn)移到已滅菌的 50 ml 離心管中再于冰上放置 5 min

3. 于 4℃ 離心，2700rmp，10 min，棄上清，收集細(xì)菌

4. 質(zhì)粒的提取

準(zhǔn)備大腸桿菌質(zhì)粒提取盒和擴(kuò)增的帶質(zhì)粒大腸桿菌培養(yǎng)液

5. 質(zhì)粒鑒定（瓊脂糖凝膠電泳）

三、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的建立

1. 準(zhǔn)備細(xì)胞：

貼壁細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前 24 h，在 500 uL 無雙抗完全培養(yǎng)基中接種 0.5~2×105個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度為 80 ~ 90% 。 

2．對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品，按下面的方法準(zhǔn)備：

（1）用 50 uL Opti-MEM 稀釋 0.8 ug 質(zhì)粒 DNA，輕輕吹吸 3 - 5 次混勻，室溫下靜置 5 min。

（2）輕輕顛倒混勻轉(zhuǎn)染試劑，用 50 uL Opti-MEM 稀釋 2.0 uL Lipofectamine TM2000，輕輕吹吸 3 - 5 次混勻，室溫下靜置 5 min。

（3）混合轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒 DNA 稀釋液，輕輕吹吸 3 - 5 次混勻，室溫下靜置 20 min。注: 轉(zhuǎn)染復(fù)合物一旦形成，應(yīng)立即加入培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

（4） 轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到 24 孔細(xì)胞板中，100 uL/孔，前后輕搖細(xì)胞板混合均勻。

（5） 將細(xì)胞板置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6 h 左右，進(jìn)行換液，換成含 10% 血清的普通培養(yǎng)基，在 37℃，5％CO2 孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 左右。

四、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選

1.從 37℃，5％CO2孵育箱中取出培養(yǎng)皿，棄去含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)基，用 PBS 沖洗細(xì)胞 2 遍，胰蛋白酶消化，接種 1/2 的細(xì)胞到 100 mm 培養(yǎng)皿中，加入含 500 ug/ml G418 的新鮮培養(yǎng)基，每 2-3 天更換一次新的篩選培養(yǎng)基，每天觀察細(xì)胞的死亡情況。

2.當(dāng)正常細(xì)胞完全死亡后，換用新的不含 G418 的培養(yǎng)基培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。

3.在細(xì)胞達(dá)到 60% 匯合率時(shí)再用含 500 ug/ml G418 的培養(yǎng)基篩選一次。

4.當(dāng)細(xì)胞達(dá)到 90% 以上匯合率時(shí)將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)（轉(zhuǎn)染后 10~12 天左右）。以后每隔 4~5 天再用含 500 ug/ml G418 的培養(yǎng)基篩選。

5.直到穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量后可以收集樣品（約轉(zhuǎn)染后 15 天左右）。以后繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)加入的 G418 濃度降一半。

注意事項(xiàng)

鋪板時(shí)要將細(xì)胞消化完全混勻，避免細(xì)胞堆積生長。

常見問題

1.LB 培養(yǎng)基的配制：在 950 ml 去離子水中加入：胰化蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g，NaCl10 g，搖動(dòng)容器直至溶質(zhì)溶解。用 5mol/LNaOH 調(diào) pH 至 7.0，用去離子水定容至 1L，在 15psi 高壓下蒸汽滅菌 20 min。

2.LB 固體培養(yǎng)基及倒板：

（1）配制：100 mlLB 培養(yǎng)基加入 1.5 g 瓊脂粉

（2）抗生素的加入：高壓滅菌后，將融化的 LB 固體培養(yǎng)基置與 55℃ 的水浴中，待培養(yǎng)基溫度降到 55℃ 時(shí)（手可觸摸）加入氨芐抗生素（終濃度為 50 μg/ml），以免溫度過高導(dǎo)致抗生素失效，并充分搖勻。

（3）倒板：一般 10 ml 倒 1 個(gè)板子。培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿后，打開蓋子，在紫外下照 10-15 分鐘。

（4）保存：用封口膠封邊，并倒置放于 4℃ 保存，一個(gè)月內(nèi)使用。