體外轉錄法合成 dsRNA
原理
根據靶基因的 DNA 模板在體外轉錄形成兩條互補 RNA 鏈，隨后將所得的 RNA 鏈退火形成 dsRNA。
用途
沉默靶基因，靶基因下游調控研究。
材料與儀器
試劑：
瓊脂糖凝膠、電泳緩沖液、ATP、CTP、GTP、UTP、DTT、DNA marker、OTT、高保真 PCR Mix 、dNTP 混合液、無水乙醇、DNA 上樣緩沖液（6X）、TBE（5X）、RNase free water、引物、PCR 緩沖液、PCR 管、各規格無酶 EP 管、苯酚 : 氯仿（1 : 1）、DNA 酶 I、乙酸鈉、Gold View 核酸染色劑、T7 聚合酶、T7 轉錄緩沖液（10X）、全基因組 DNA。
設備：
核酸電泳儀、PCR 儀、金屬浴、凝膠成像系統。
步驟
一、制備模板
1、查閱基因序列庫、下載目的基因的序列。
2、選擇長度為 400~800 bp 的目的基因序列作為體外轉錄的模板。
3、將序列進行 BLAST 比對，分析其特異性，特異性不好則需要重新選取。
4、用 Primer5.0 設計目的基因的引物。
5、將 T7 啟動子序列（5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′）加到兩條引物的 5' 端，需要準備兩隊引物分別帶有 T7 啟動子序列或者不帶。
6、分別用每對引物進行 PCR 合成 DNA 模板，在 200 μl 的 RNAse free 的 EP 管中配置 PCR 體系：
模板 DNA | 基因組 DNA：6 ug |
RNase Free dH2O | Add to 100 μl |
SYBR Taq 酶（2×） | 50 μl |
正向引物（10 μM） | 5 μl |
反向引物（10 μM） | 5 μl |
總反應體積 | 100 μl |
7、混勻后渦旋離心到管底，放入 PCR 儀中，進行如下擴增：
Cycle | Cycle Point |
Hold 94 ℃，5 min | |
Cycling（25 repeats） | Step1：94 ℃，hold 30 s |
Step2：64 ℃，hold 30 s | |
Step3：72 ℃，hold 10 s | |
Hold 72 ℃，5 min | |
Hold 72 ℃，5 min |
8、制備 1% 的瓊脂糖凝膠電泳
9、反應結束后將 5 μl 的 PCR 產物與 1 μl DNA 緩沖液（6X）混勻，然后加到上樣孔中進行電泳。
10、將剩余的 PCR 產物轉移至一個新的 800 μl EP 管中，加入 1/10 體積的乙酸鈉（3 mol/L，pH 5.2）和 2.5 倍體積的無水乙醇，渦旋混勻，在 -20 ℃ 或者更低的溫度下放置 30 min 以上，使 PCR 產物沉淀。4 °C 16 000 g 離心 30 min，棄去上清。用 1 ml 70％ 乙醇洗沉淀以去除殘留的鹽類。4 ℃ 16 000 g 離心 5 min，盡量去上清，然后將離心管開蓋放置數分鐘使乙醇揮發。
11、將 DNA 沉淀溶解于 50 μl 水。
二、制備 dsRNA
1、將 T7RNA 聚合酶置于冰上，按下表配置 100 μl 體外轉錄體系：
RNase Free dH2O | 56.5 μl |
T7 轉錄緩沖液（10X） | 10 μl |
PCR 模板 DNA | 5 μl |
ATP ( 100 mmol/L） | 5 μl |
CTP ( 100 mmol/L） | 5 μl |
UTP ( 100 mmol/L） | 5 μl |
GTP ( 100 mmol/L） | 8 μl |
OTT （1 mol/L) | 0.5 μl |
T7RNA 聚合酶 | 0.5 μl（100 U） |
2、將試劑離心到 EP 管底部，37 ℃ 孵育 120 min。
3、加入 5 μl DNA 酶 I，渦旋將其離到管底，37 ℃ 孵育 30 min。
4、加入等體積的酚 : 氯仿（1 : 1），渦旋 30 s。4 ℃ 最大轉速離心 15 min，將上層液相轉移至一個新的 1.5 ml 微量離心管中。
5、向液相中加入 1/10 體積的乙酸鈉（3 mol/L，pH 5.2）和 2.5 倍體積的無水乙醇，渦旋混勻，在 -20 ℃ 放置 30 min 以上，使 PCR 產物沉淀。4 ℃ 16 000 離心 30 min。
6、棄去上清。加入 1 ml 70％ 乙醇洗滌沉淀，以去除殘留的鹽類。4 ℃ 16 000 離心 5 min 使 RNA 沉淀，最大限度地棄去上清（70％ 乙醇），然后將離心管開蓋放置數分鐘使乙醇揮發。
7、將 RNA 沉淀溶解于 100 μl 的無核酸酶水中。利用 Nanodrop 測量 RNA 的濃度和純度。
8、使兩條鏈復性，生成 0.5 μmol/L 的 dsRNA 溶液：
9、將 EP 管放在金屬浴上 95℃，1 min，自然冷卻至室溫。
10、向液相中加入 1/10 體積的乙酸鈉（3 mol/L，pH 5.2）和 2.5 倍體積的無水乙醇，渦旋混勻，在 -20 ℃ 放置 30 min 以上，使 PCR 產物沉淀。4 ℃ 16 000 g 離心 30 min。棄去上清。加入 1 ml 70％ 乙醇洗滌沉淀，以去除殘留的鹽類。4 ℃ 16 000 g 離心 5 min 使 RNA 沉淀，最大限度地棄去上清（70％ 乙醇），然后將離心管開蓋放置數分鐘使乙醇揮發。
11、用 RNase free water 溶解 RNA，置于 -80 ℃ 保存備用。
三、dsRNA 完整性檢測
1、制備 1% 的瓊脂糖凝膠電泳
2、反應結束后將 5 μl 的 PCR 產物與 1 μl DNA 緩沖液（6X）混勻，然后加到上樣孔中進行電泳。
3、將凝膠取下，在中 Gold View 核酸染色劑進行顯色，然后在 1X TBE 中漂洗 3 次，每次 5 min，上機進行檢測。
注意事項
1、提 RNA 時濃度太低，可以在提取過程中適當加長沉淀時間，沉淀過夜，或者加微量糖原。
2、檢測 dsRNA 完整性過程發現有其他條帶，可能是 RNA 降解或者轉錄出來的 RNA 不特異。
3、目的基因序列不宜過長，否則特異性降低，容易會產生雜帶污染。
常見問題
問題 1：提 RNA 時濃度太低？
答：可以適當提高模板濃度，延長體外轉錄時間，以及在提取過程中適當加長沉淀時間，沉淀過夜。
問題 2：dsRNA 完整性檢測過程中發現雜帶？
答：實驗耗材均采用無 RNA 酶試劑、EP 管、移液器吸頭，避免降解目的 dsRNA。
