一氧化氮含量測定

簡介

NO（Nitric Oxide，NO）廣泛分布于生物體內，包括神經、循環、呼吸、消化、泌尿生殖等系統中，尤其是神經組織中較為豐富。它作為細胞間及細胞內的信息物質，發揮信號傳遞的作用，是一種新型的生物信使分子，在機體的生理、病理過程中起著重要的作用。

原理

NO 是一種極不穩定的生物自由基，在體內或水溶液中極易氧化生成 NO22- 和 NO33-，NO33- 可以通過鎘被還原為 NO22-，NO22- 在酸性條件下與重氮鹽磺酸胺生成重氮化合物生成重氮化合物，再與萘基乙烯基二胺進行偶聯反應，生成有顏色的化合物，通過分光光度計在 550 nm 下測定吸光度值，并制作標準曲線，通過標準曲線可以計算 NO 含量。

材料與儀器

天平、分光光度計/酶標儀、低溫離心機

水浴鍋/恒溫培養箱、玻璃比色皿/96 孔板

移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水、EP 管

一氧化氮（NO）含量檢測試劑盒（索萊寶 BC1475）

溶液的配制：

1、 試劑一：粉劑置于試劑瓶內玻璃瓶中。臨用前加入 2.5 mL 蒸餾水混勻，-20 ℃ 分裝保存兩周，避免反復凍融；

2、 顯色液：臨用前按照實驗所需用量按 A 液 : B 液 = 1 : 1 充分混勻，現配現用；

3、 標準品：10 μmol/mL 亞硝酸鈉。

步驟

一、樣本處理

1、組織樣本：按質量（g）: 提取液體積（mL）1 : 5~10 比例（建議稱取 0.2 g 樣本，加入 1.0 mL 提取液）加入提取液，冰浴勻漿后，于 4 ℃，12000 rpm，離心 15 min，棄沉淀，取上清液于冰上待測。

2、細胞樣本：按細胞數量（104）: 提取液體積（mL）500~1000 : 1 的比例（建議 1000 萬細胞加入 1.0 mL 提取液）加入提取液，冰浴超聲破碎細胞（功率 300 w，超聲 3 s，間隔 7 s，總時間 3 min），然后于 4 ℃，12000 rpm，離心 15 min，棄沉淀，取上清液于冰上待測。

3、液體樣本：直接測定，若液體有渾濁則離心取上清測定。

二、測定步驟

1、分光光度計/酶標儀預熱 30 min 以上，調節波長至 550 nm，蒸餾水調零。

2、將試劑一置于冰上備用。

3、標準液的稀釋：將標準品用蒸餾水倍比稀釋至 0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125 μmol/mL。標準液稀釋可參考下表：

備注：實驗中每個標準管需 100 μL 標準溶液。

4、操作表： 

漩渦混勻，置于 37 ℃ 恒溫培養箱/水浴鍋中水浴 60 min。 

漩渦混勻，室溫靜置 5 min，3500 rpm 離心 10 min，取上清液待測。

漩渦混勻，室溫靜置 10 min，用玻璃比色皿/96 孔板在 550 nm 下測定吸光值 A，分別記為 A 空白、A 測定、A 標準，計算 ΔA 標準 = A 標準 - A 空白，ΔA 測定 = A 測定 - A 空白。標準曲線和空白管只需測 1~2 次。

三、NO 含量計算

1、標準曲線的繪制：

以各個標準溶液的濃度為 X 軸（X，μmol/mL），其對應的 ΔA 標準為 Y 軸（Y，ΔA 標準），繪制標準曲線，得到標準方程 Y = kX + b，將 ΔA 測定帶入方程得到 X（μmol/mL）。

2、NO 含量的計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算

NO 含量（μmol/mg prot）= X × V 樣 ÷（V 樣 × Cpr）= X ÷ Cpr

（2）按樣本質量計算

NO 含量（μmol/g 質量）= X × V 樣 ÷（W × V 樣 ÷ V 樣總）= X ÷ W

（3）按樣本細胞數量計算

NO 含量（μmol/104 cell）= X × V 樣 ÷（V 樣 × 細胞數量 ÷ V 樣總）= X ÷ 細胞數量

（4）按樣本液體體積計算

NO 含量（μmol/mL）= X × V 樣 ÷ V 樣 = X

V 樣：加入樣本體積，0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；

W：樣本質量，g；細胞數量：以 104 為單位，萬個。

注意事項

1、試劑盒 2~8 ℃ 保存。最低檢出限：0.0004 μmol/mL，線性范圍：0.00078~0.1 μmol/mL。檢測值最好落在檢出限的中間區段，增加數據的可靠性。                                                            

2、盡量使用新鮮樣品進行檢測。實驗之前建議選擇 2~3 個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。