微量 RNA 建庫測序方案
簡介
RNA 測序 (RNA Sequencing，簡稱 RNA-Seq) ，是基于高通量測序技術的轉錄組學研究方法，可以快速對基因組中的 RNA 種類和數量進行分析，揭示特定生物學或疾病發生過程中的分子機制。RNA 文庫制備通常需要 100 ng 以上的起始 RNA，然而實際的科研實驗中常會遇到樣本本身較少或類型特殊，導致 RNA 起始量不足的情況，給建庫實驗帶來極大的挑戰。本章內容我們將為大家介紹微量 RNA（單細胞或低至 10 pg RNA）的特殊建庫方案。
原理
針對單細胞/微量細胞（1-1000 cells）轉錄組測序，目前使用的是 SMART 擴增技術。
具體步驟及反應原理如下：
1、使用 oligo dT 針對 RNA 聚合酶 II 轉錄的 RNA（具有 polyA 結構）進行逆轉錄（從而避開 rRNA）；
2、逆轉錄到 5 cap 的時候，逆轉錄酶的末端轉移酶活性會不依賴于 RNA 模板， 在 cDNA 的末端加上多個 C（一般是 3 個）；
3、然后使用一個帶有 GGG 的接頭（圖中的 TS oligo）與 CCC 進行配對，利用逆轉錄酶的 template switch 特征，繼續以這個 TS oligo 為模板合成 DNA。這樣 cDNA 的 3』就會加上 TS oligo 的序列；
4、進而以 TS oligo 配對的引物，對這個 cDNA 分子進行擴增。通過此方式，就可以將全長 RNA 進行指數擴增；
5、然后對擴增獲得的 DNA 分子進行文庫構建、測序及數據分析。
材料與儀器
QIAseq UPX 3' Transcriptome Kit (QIAGEN，低至單細胞或 10 pg RNA 的 3' RNA-seq 建庫試劑盒）
QIAseq UPXome RNA Lib Kit (QIAGEN，低至 500 pg RNA 全轉錄組建庫試劑盒，下文實驗步驟基于此試劑盒）
1.5 ml 或 2 ml 離心管、無菌吸頭
一次性手套
乙醇（96%–100%）
純化磁珠與磁力架
離心機
Vortex 漩渦震蕩儀
PCR 儀
步驟
1．按表 1 準備 rRNA 去除反應體系，輕微震蕩混勻。
2．按表 2 進行反應：
3．按表 3 準備 cDNA 合成反應體系，輕微震蕩混勻。
4．將 cDNA 合成反應組分加入到 SID-TS-96S 孔板中，輕微震蕩混勻并離心。
5．按表 4 進行反應：
6．合成后的 cDNA，可以選 8—24 個放于 1 個 2 ml 離心管中，多個 cDNA 可以混合構建一個文庫。
7．加入 1.1X 體積的 QIAseq beads 對 cDNA 產物進行純化。
8．室溫孵育 5min
9．將反應管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液體變澄清（約 2min），小心移去上清。
10．將反應管放置于磁力架上，加入 200 μl新鮮配制的 80% 乙醇清洗磁珠，小心吸除乙醇，勿干擾磁珠。
11．重復第 14 步的乙醇洗滌一次。
12．在磁力架上孵育 5—10min 或至磁珠晾干，磁珠過度干燥可能會導致 DNA 產量降低。
13．使用 22μl 的無核酸酶水來重懸磁珠，將反應管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液體變澄清，小心吸取 20 μl 的上清至新的 PCR 板中。
14．向每個樣本中加入 22μl（1.1X）重懸后的磁珠。重復第 8-12 步。使用 25 μl 的無核酸酶水來重懸磁珠，將反應管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液體變澄清，小心吸取 23 μl 的上清至新的 PCR 板中。
15．按表 5 步驟進行 PCR 儀（需帶有熱蓋）程序設定
16．按表 6 設置 PCR 循環反應，PCR 循環數參考表 7。
17．加入 40 μl磁珠進行純化，室溫孵育 5min
18．將反應管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液體變澄清（約 2min），小心移去上清。
19．將反應管放置于磁力架上，加入 200 μl新鮮配制的 80% 乙醇清洗磁珠，小心吸除乙醇，勿干擾磁珠。
20．重復第 19 步的乙醇洗滌一次。
21．在磁力架上孵育 5—10min 或至磁珠晾干，磁珠過度干燥可能會導致 DNA 產量降低。
22．使用 22μl 的無核酸酶水來重懸磁珠，將反應管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液體變澄清，小心吸取 20 μl 的上清至新的 PCR 板中。
23．向每個樣本中加入 16μl（0.8X）重懸后的磁珠。重復第 18-22 步。使用 24 μl 的無核酸酶水來重懸磁珠，將反應管放置于磁力架上，使磁珠聚集直到液體變澄清，小心吸取 22 μl 的上清至新的 PCR 板中。純化后的文庫可保存在-20°C 直至測序。
注意事項
1. SMART 技術的轉錄酶具有末端轉移酶活性，單管反應一步完成逆轉錄和二鏈合成，不需要額外的 cDNA 純化和二鏈合成反應，簡化了建庫流程并節省了操作時間。
2. 微量建庫測序能否成功，在實驗方面一個重要的因素就是降低核糖體在 Total RNA 中的比例。使用 polyT 引物反轉錄雖然能避免 rRNA，但是很難獲得全長 RNA 數據。本方案結合了 rRNA 去除「黑科技」QIAseq FastSelect，整個 rRNA 去除反應完美融入逆轉錄步驟中，無需任何操作以及額外純化步驟。這一「黑科技」可將總 RNA 中的 rRNA「封閉」住，使其不能進行反轉錄、二鏈合成等反應，最終無法進入構建好的 NGS 文庫，顯著降低 rRNA 干擾，減少測序成本的同時降低數據分析難度并提高結果的準確性。且這一方法不受起始樣本量限制，低至單細胞裂解釋放的 RNA 都可以進行 rRNA 去除。
3. 當 RNA 起始量較低時，測序所需的數據量也不必過高，每個樣本單獨構建文庫既浪費建庫試劑，又增加了操作時間。本方案支持 8—24 個 cDNA 混合建庫，只要將不同樣本反轉錄得到的 cDNA 混合純化，構建一個混合 RNA-seq 文庫即可。高通量測序后，根據反轉錄時引入的樣本標簽（Sample ID）拆分出每個樣本的基因表達信息即可，節省成本的同時也提高了實驗效率。
