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Sanger測序
發布日期:2024-10-12 10:19:32


Sanger測序


sanger是英國生物化學家,1918年8月13日生于英格蘭格洛斯特夏郡,在劍橋大學圣· 約翰學院獲哲學博士學位,畢業后到知名的劍橋醫學研究會分子生物學實驗室工作。Sanger的工作主要研究蛋白質的結構,特別是研究測定胰鳥素分子的結構,成功地測定了胰鳥素的精細結構,因而獲得了1958年的諾貝爾化學獎。

 

60年代后他致力于核糖核酸(RNA)和(脫氧核糖核酸)DNA的結構研究,利用酶解圖譜法確定了RNA中各種堿基的排列順序和DNA中核甙酸的排列順序,所以1980年再度獲諾貝爾化學獎。

 

Sanger酶學法的原理[2]即用雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑,通過聚合酶的引物延伸產生一系列大小不同的分子后再進行分離的方法。測序引物與單鏈DNA模板分子結合后,DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反應分四組進行,每一組分別用四種ddNTP中的一種來進行終止,再用PAGE分析四組樣品。

 

雙脫氧核苷酸在脫氧核糖上沒有聚合酶延伸鏈所需要的3’-OH基團,所以可被用作鏈終止試劑。從得到的PAGE膠上可以讀出我們需要的序列。

 

以該法為基礎,Sanger后來對它進行了許多改進,使之更適合實際操作,為后來的大規模測序提供了技術支持,其中一個重要改進是利用單鏈DNA噬菌體載體將隨機打斷的DNA片斷分別測序,在拼成完整DNA。

 

在1980年發表的論文中,他提出將小片斷的DNA在ssDNA噬菌體中的克隆與末端終止法結合可以提高測序速度。將限制性內切酶酶切得到的DNA隨機片斷,利用一段連接寡聚核苷酸插入修飾過的噬菌體M13mp2的EcoRI位點,培養收集重組噬菌體,并分離DNA。

 

用來自噬菌體載體的“側翼引物”通過鏈末端終止法來測每個插入的DNA的序列。該法在積累數據方面迅速,簡便,人類線粒體DNA中較大的限制性酶的片斷Mbol(2771個核苷酸)就是用這種方法測得的。

 

sanger的酶法測序技術是今天大規模基因組測序的基礎。DNA測序,測定組成人類染色體30億對堿基的宏大工程,是人類基因組計劃較大的挑戰。達到這個目標將幫助我們揭示人體兩萬多個基因的秘密。基因組序列圖譜將成為21世紀的科學家探索人類生物學和其他更加復雜的現象的有力工具。

 

隨著測序技術的進步,基因組測序的步伐也越來越快,在人類基因組計劃完成后,其他模式生物的基因組測序工作也開展起來,基因組數據庫中的數據以指數形式迅速增長。這些數據為廣大的科研工作者提供了方便,并促進了多種新研究方法的產生。蛋白質組學也在其推動下迅速發展起來,DNA序列為蛋白質的一級結構提供了參考。

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