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GST pull down
發布日期:2024-10-12 10:17:13


GST pull down


GST pull down(GST融合蛋白沉降技術)是體外檢測蛋白相互作用的常用方法,可驗證已知蛋白之間的互作,也可用于篩選與已知蛋白互作的未知蛋白。此方法操作方便,簡單易行。


GST pull down實驗原理

GST pull down的主要原理是利用DNA重組技術將已知蛋白與GST融合,而融合蛋白通過GST與固化在載體上的GTH(谷胱甘肽)親和結合。簡單來說,我們假定a蛋白和b蛋白可能存在互作,將純化的融合GST的a蛋白和純化的b蛋白以及能特異性結合GST的Sephrose 4B beads混合在一起孵育一定時間,然后洗去未結合的蛋白,煮沸beads進行SDS-PAGE電泳。通過Western blot檢測結果,我們可以看到GST-a蛋白和b蛋白所對應的條帶,即表明了a蛋白和b蛋白因發生相互作用而被GST-a pull down(GST對照只顯示一個條帶)。

GST pull down實驗步驟

GST-a融合蛋白的制備

1.GST-a融合蛋白的表達

(1)將目的蛋白與GST的重組質粒轉化到BL21菌株中;

(2)挑取單克隆到含有5ml LB培養基(加入5ul氨芐)的10ml試管里,37℃恒溫振蕩培養箱中培養過夜;

(3)將培養菌液轉移到含有500ml LB(含500ul氨芐)的1L錐形瓶中,37℃,200rpm培養數小時;

(4)測定OD600值,當OD600達到0.6左右時,加入適當濃度的IPTG,在20℃,200rpm條件下培養10-16h(通常需要進行預實驗以確定較佳IPTG濃度、誘導溫度和時間);

(5)誘導適當時間后,將菌液分次倒入50ml離心管中,4℃ 4000rpm離心10分鐘,然后棄去上清,收集管底菌體,如暫時不用,可將菌體保存于-80℃冰箱中;

(6)先加入少量PBS于離心管中,離心5-10min后棄去上清,再按每10ml菌液沉淀1ml PBS的量加入相應的PBS,渦旋振蕩,使菌體沉淀充分溶解于PBS溶液中;

(7)把混合菌體置于冰水浴中,用超聲儀進行破碎。每次超聲破碎20s,間隔30s(破碎時間、破碎次數和間隔時間視具體情況而定),經過適當時間超聲后,溶液會顯得澄清;

(8)將超聲后的溶液4℃ 4000rpm離心10分鐘,上清液轉移至新的離心管中,-80℃保存備用。


2.GST-a融合蛋白的純化

(1)在新鮮制備的裂解液上清中加入適量體積50% Glutathione Sepharose 4B,4℃搖床上緩慢搖動30~60min;

(2)4℃,4000rpm離心5min,棄去上清,該Sepharose上結合了GST-a融合蛋白;

(3)加入200ul預冷的PBS溶液,輕晃懸浮珠子,將Sepharose洗滌一次,4℃,4000rpm離心5min,棄去上清,重復此步驟3次;

(4)最后一次用移液槍吸走珠子表面的液體,但注意不要吸走珠子,即可獲得結合GST-a的Sepharose。


b蛋白的制備

b蛋白可融合His標簽進行原核表達,也可融合Flag/HA/Myc等標簽進行真核表達。


體外蛋白的結合

(1)將結合有GST-a融合蛋白的Sepharose 4B懸浮在適量體積的緩沖液中,加入20ul含有b蛋白的溶液,同時采用結合有GST蛋白的Sepharose作為陰性對照,在搖床上晃動4-8h(4℃);

(2)4℃,4000rpm離心5min,棄去上清液;

(3)沿壁加入200ul預冷的緩沖液對Sepharose進行洗滌,

(4)4℃,4000rpm離心5min,棄上清,該步驟重復3次;

(5)吸干Sepharose上面的液體后,加入20ul 1×蛋白電泳上樣緩沖液,沸水浴5min,放入-20℃冰箱備用;

(6)通過SDS-PAGE和Western blot進行檢測。

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