染色質免疫沉淀CHIP-pcr

染色質免疫共沉淀技術（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究體內蛋白質與DNA相互作用的有力工具，通常用于轉錄因子結合位點或組蛋白特異性修飾位點的研究。將ChIP與新一代測序技術相結合的ChIP-Seq技術，能夠效率高地在全基因組范圍內檢測與組蛋白、轉錄因子等互作的DNA區段。

1、對照的選擇

Input對照：

在進行免疫沉淀前，需要取一部分斷裂后的染色質做Input對照。Input是斷裂后的基因組DNA，需要與沉淀后的樣品DNA一起經過逆轉交聯，DNA純化，以及最后的PCR或其他方法檢測。Input對照不僅可以驗證染色質斷裂的效果，還可以根據Input中的靶序列的含量以及染色質沉淀中的靶序列的含量，按照取樣比例換算出ChIP的效率，所以Input對照是ChIP實驗必不可少的步驟。

Beads選擇：

接下來，利用目的蛋白質的特異抗體通過抗原-抗體反應形成DNA-蛋白質-抗體復合物，然后使用Agarose beads或Magna beads沉淀此復合物，特異性地富集與目的蛋白結合的DN***段。再經過多次洗滌，除去非特異結合的染色質后，用SDS+NaHCO3洗脫免疫沉淀復合物。

2、抗體選擇：

染色質免疫沉淀所選擇的目的蛋白的抗體是ChIP實驗成功的關鍵。因為在蛋白質與染色質交聯結合時，抗體的抗原表位可能因為與結合位點的距離太近，不能被抗體識別，所以不能有效地在體內形成免疫沉淀復合物，直接影響ChIP的結果。所以不是所有的抗體都能做ChIP實驗的，只有經過ChIP實驗驗證后的抗體才能確保實驗結果的可靠性。

3、陽性與陰性對照：

在做ChIP實驗時，一定要做好實驗對照，因為沒有對照，很難對實驗結果的可靠性進行評估。陽性抗體和陰性抗體對照是基本的實驗對照。陽性抗體通常選擇與已知序列相結合的比較保守的蛋白的抗體，常用的包括組蛋白抗體或RNA Polymerase II抗體等。陰性抗體通常選擇目的蛋白抗體宿主的IgG或血清。目的蛋白抗體的結果與陽性抗體和陰性抗體的結果相比較，才能得出正確結論。另外，還應考慮目的蛋白抗體與DNA的非特異性結合的可能，所以通常還會選擇一對陰性引物，即目的蛋白肯定不會結合的DNA序列，作為該抗體的陰性對照。較佳的陰性對照引物是在靶序列上游的一段與目的蛋白肯定不能結合的序列。如果目的蛋白沒有商品化的適用于染色質免疫沉淀實驗的抗體，只有其他用途的抗體時，可以先做蛋白質免疫沉淀（Immunoprecipitation）檢測。如果抗體可以成功的沉淀蛋白，再進行染色質免疫沉淀實驗的檢測。

4、CHIP實驗操作規程

4.1. 交聯反應的逆轉和DNA的純化

用不含DNase的RNase和Proteinase K，65oC保溫6小時逆轉交聯，經DNA純化柱回收DNA或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀純化DNA。DNA純化柱純化DNA的質量高，有利于下一步PCR等方法的檢測。因為甲醛不僅交聯DNA-蛋白質，還交聯蛋白質-蛋白質，所以還可以對DNA序列上的蛋白質復合物進行分析。在逆轉交聯時不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有機相中的蛋白質，進行分析。

4.2. DNA的鑒定

常用的DNA的鑒定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于啟動子區域的序列具有多樣性的特點，所以不同的細胞系或不同的動物品系的同一基因的啟動子序列有可能不同。而且啟動子區域多富含CG的序列，其PCR條件可能需要相應調整。有條件可設計不止一對引物來反復驗證ChIP實驗的結果（圖2）。

5、ChIP技術的應用

染色質免疫沉淀的DNA適用于多種分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要驗證的，可采用狹縫雜交（Slot blot）的方法，把靶序列特異性探針與染色質免疫沉淀的DNA雜交，來驗證目的蛋白與DNA靶序列的特異性結合。還可以根據靶序列設計引物，用半定量PCR的方法進行測定，或采用Real-time PCR方法進行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的（high-throughput），可采用Southern雜交。但因為免疫沉淀的DNA量較少，所以在研究時通常要用PCR方法擴增DNA探針，再進行整個基因組掃描。還可以把沉淀的DNA克隆到載體中，進行測序，尋找該序列附近的開放閱讀框，發現新的基因調節序列。