表達(dá)載體的構(gòu)建方法及步驟
一、載體的選擇及如何閱讀質(zhì)粒圖譜
目前,載體主要有病毒和非病毒兩大類,其中質(zhì)粒 DNA 是一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體。
一個(gè)合格質(zhì)粒的組成要素:
(1)復(fù)制起始位點(diǎn) Ori 即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原核生物 DNA 分子中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。而
真核生物 DNA 分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。
(2)抗生素抗性基因可以便于加以檢測,如 Amp+ ,Kan+
(3)多克隆位點(diǎn) MCS 克隆攜帶外源基因片段
(4) P/E 啟動(dòng)子/增強(qiáng)子
(5)Terms 終止信號(hào)
(6)加 poly(A)信號(hào)可以起到穩(wěn)定 mRNA 作用
選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的,同時(shí)要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的目
的是要表達(dá)一個(gè)特定的基因,則要選擇合適的表達(dá)載體。
載體選擇主要考慮下述3點(diǎn):
【1】構(gòu)建 DNA 重組體的目的,克隆擴(kuò)增/基因表達(dá),選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體。
【2】.載體的類型:
(1)克隆載體的克隆能力-據(jù)克隆片段大小(大選大,小選小)。如<10kb 選質(zhì)粒。
(2)表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類型-原核/真核/穿梭,E.coli/哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體。
(3)對(duì)原核表達(dá)載體應(yīng)該注意:選擇合適的啟動(dòng)子及相應(yīng)的受體菌,用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)時(shí)注意克服4個(gè)困難和閱讀框錯(cuò)位;表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考。
【3】載體 MCS 中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異,適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接,不能產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位。
綜上所述,選用質(zhì)粒(常用)做載體的5點(diǎn)要求:
(1)選分子量小的質(zhì)粒,即小載體(1-1.5kb)→不易損壞,在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多(也有大載體);
(2)一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束,一般 10個(gè)以上的拷貝,而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個(gè)。
(3)需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn),有選擇的余地;
(4)需有易檢測的標(biāo)記,多是抗生素的抗性基因,不特指多位 Ampr(試一試)。
(5)滿足自己的實(shí)驗(yàn)需求,是否需要包裝病毒,是否需要加入熒光標(biāo)記,是否需要加入標(biāo)簽蛋白,是否需要真核抗性(如Puro、G418)等等。
無論選用哪種載體,首先都要獲得載體分子,然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體 DNA 進(jìn)行切割,獲得線性載體分子,以便于與目的基因片段進(jìn)行連接。
如何閱讀質(zhì)粒圖譜
第一步:首先看 Ori 的位置,了解質(zhì)粒的類型(原核/真核/穿梭質(zhì)粒)
第二步:再看篩選標(biāo)記,如抗性,決定使用什么篩選標(biāo)記。
(1)Ampr 水解β-內(nèi)酰胺環(huán),解除氨芐的毒性。
(2)tetr 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。
(3)camr 生成氯霉素羥乙酰基衍生物,使之失去毒性。
(4)neor(kanr)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使 G418(長那霉素衍生物)失活
(5)hygr 使潮霉素β失活。
第三步:看多克隆位點(diǎn)(MCS)。它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。如果在這些酶切位點(diǎn)以外有外源基因的插入,會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活,而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。
第四步:再看外源 DNA 插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb 的外源 DNA 片段。一般來說,外源 DNA 片段越長,越難插入,越不穩(wěn)定,轉(zhuǎn)化效率越低。
第五步:是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件,即啟動(dòng)子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。這是用來區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體。克隆載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體,還是要以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。
第六步:啟動(dòng)子-核糖體結(jié)合位點(diǎn)-克隆位點(diǎn)-轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)
(1)啟動(dòng)子-促進(jìn) DNA 轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列,這個(gè) DNA 區(qū)域常在基因或操縱子編碼序列的上游,是 DNA 分子上可以與 RNApol 特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位,但啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄。
(2)增強(qiáng)子/沉默子-為真核基因組(包括真核病毒基因組)中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序。其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子-負(fù)增強(qiáng)子,負(fù)調(diào)控序列。
(3)核糖體結(jié)合位點(diǎn)/起始密碼/SD 序列(Rbs/AGU/SDs):mRNA 有核糖體的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn),對(duì)于原核而言是 AUG(起始密碼)和 SD 序列。
(4)轉(zhuǎn)錄終止序列(終止子)/翻譯終止密碼子:結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA的保守序列,此位點(diǎn) down-stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū),這2部分共同構(gòu)成 poly(A)加尾信號(hào)。結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA 的保守序列,此位點(diǎn) down-stream 有一段GT 或 T 富豐區(qū),這2部分共同構(gòu)成 poly(A)加尾信號(hào)。
質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時(shí)針有的箭頭逆時(shí)針,那其實(shí)是代表兩條 DNA 鏈,即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA,它的啟動(dòng)子等在其中一條鏈上,而它的抗性基因在另一條鏈上 .根據(jù)表達(dá)宿主不同,構(gòu)建時(shí)所選擇的載體也會(huì)不同。
二、目的基因的獲得
一般來說,目的基因的獲得有三種途徑:
調(diào)取基因:根據(jù)目的基因的序列,設(shè)計(jì)引物從含有目的基因的cDNA中通過PCR的方法調(diào)取目的基因,鏈接到克隆載體挑取單克隆進(jìn)行測序,以獲得想要的基因片段,這種方法相對(duì)成本較低,但是調(diào)取到的基因往往含有突變,還有不同基因的表達(dá)豐度不同,轉(zhuǎn)錄本比較復(fù)雜,或是基因片段很長,這些情況都很難調(diào)取到目的基因。
全基因合成:根據(jù)目的基因的DNA序列,直接設(shè)計(jì)合成目的基因。此方法準(zhǔn)確性高,相對(duì)成本會(huì)高一些,個(gè)人操作比較困難,需要專業(yè)的合成公司完成。優(yōu)點(diǎn)是可以合成難調(diào)取及人工改造的任何基因序列,同時(shí)可以進(jìn)行密碼子優(yōu)化,提高目的基因在宿主內(nèi)的表達(dá)量。
三、克隆構(gòu)建
目前,克隆構(gòu)建的方法多種多樣,除了應(yīng)用廣泛的酶切鏈接以外,現(xiàn)在還有很多不依賴酶切位點(diǎn)的克隆構(gòu)建方式。下面具體說一下雙酶切方法構(gòu)建載體的步驟。