表達(dá)載體的構(gòu)建方法及步驟

一、載體的選擇及如何閱讀質(zhì)粒圖譜

目前，載體主要有病毒和非病毒兩大類,其中質(zhì)粒 DNA 是一種新的非病毒轉(zhuǎn)基因載體。

一個(gè)合格質(zhì)粒的組成要素：

（1）復(fù)制起始位點(diǎn) Ori 即控制復(fù)制起始的位點(diǎn)。原核生物 DNA 分子中只有一個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。而

真核生物 DNA 分子有多個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以檢測，如 Amp+ ,Kan+

（3）多克隆位點(diǎn) MCS 克隆攜帶外源基因片段

（4） P/E 啟動(dòng)子/增強(qiáng)子

（5）Terms 終止信號(hào)

（6）加 poly（A）信號(hào)可以起到穩(wěn)定 mRNA 作用

選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的目

的是要表達(dá)一個(gè)特定的基因，則要選擇合適的表達(dá)載體。

載體選擇主要考慮下述3點(diǎn)：

【1】構(gòu)建 DNA 重組體的目的，克隆擴(kuò)增/基因表達(dá)，選擇合適的克隆載體/表達(dá)載體。

【2】.載體的類型：

（1）克隆載體的克隆能力－據(jù)克隆片段大小（大選大，小選小）。如<10kb 選質(zhì)粒。

（2）表達(dá)載體據(jù)受體細(xì)胞類型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細(xì)胞表達(dá)載體。

（3）對(duì)原核表達(dá)載體應(yīng)該注意：選擇合適的啟動(dòng)子及相應(yīng)的受體菌，用于表達(dá)真核蛋白質(zhì)時(shí)注意克服4個(gè)困難和閱讀框錯(cuò)位；表達(dá)天然蛋白質(zhì)或融合蛋白作為相應(yīng)載體的參考。

【3】載體 MCS 中的酶切位點(diǎn)數(shù)與組成方向因載體不同而異，適應(yīng)目的基因與載體易于鏈接，不能產(chǎn)生閱讀框架錯(cuò)位。

綜上所述，選用質(zhì)粒（常用）做載體的5點(diǎn)要求：

（1）選分子量小的質(zhì)粒，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細(xì)菌里面拷貝數(shù)也多（也有大載體）；

（2）一般使用松弛型質(zhì)粒在細(xì)菌里擴(kuò)增不受約束，一般 10個(gè)以上的拷貝，而嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒<10個(gè)。

（3）需具備一個(gè)以上的酶切位點(diǎn)，有選擇的余地；

（4）需有易檢測的標(biāo)記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位 Ampr（試一試）。

（5）滿足自己的實(shí)驗(yàn)需求，是否需要包裝病毒，是否需要加入熒光標(biāo)記，是否需要加入標(biāo)簽蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。

無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當(dāng)?shù)南拗泼笇⑤d體 DNA 進(jìn)行切割，獲得線性載體分子，以便于與目的基因片段進(jìn)行連接。

如何閱讀質(zhì)粒圖譜

第一步：首先看 Ori 的位置，了解質(zhì)粒的類型（原核/真核/穿梭質(zhì)粒）

第二步：再看篩選標(biāo)記，如抗性，決定使用什么篩選標(biāo)記。

（1）Ampr 水解β－內(nèi)酰胺環(huán)，解除氨芐的毒性。

（2）tetr 可以阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。

（3）camr 生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。

（4）neor（kanr）氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使 G418（長那霉素衍生物）失活

（5）hygr 使潮霉素β失活。

第三步：看多克隆位點(diǎn)（MCS）。它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。如果在這些酶切位點(diǎn)以外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于10Kb 的外源 DNA 片段。一般來說，外源 DNA 片段越長，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。

第五步：是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件，即啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。這是用來區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體。克隆載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件即成為表達(dá)載體。選用那種載體，還是要以實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闇?zhǔn)繩。

第六步：啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)

（1）啟動(dòng)子－促進(jìn) DNA 轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列，這個(gè) DNA 區(qū)域常在基因或操縱子編碼序列的上游，是 DNA 分子上可以與 RNApol 特異性結(jié)合并使之開始轉(zhuǎn)錄的部位，但啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄。

（2）增強(qiáng)子/沉默子－為真核基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強(qiáng)鄰近基因轉(zhuǎn)錄過程的調(diào)控順序。其作用與增強(qiáng)子所在的位置或方向無關(guān)。即在所調(diào)控基因上游或下游均可發(fā)揮作用。/沉默子－負(fù)增強(qiáng)子，負(fù)調(diào)控序列。

（3）核糖體結(jié)合位點(diǎn)/起始密碼/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖體的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)于原核而言是 AUG（起始密碼）和 SD 序列。

（4）轉(zhuǎn)錄終止序列（終止子）/翻譯終止密碼子：結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA的保守序列，此位點(diǎn) down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成 poly（A）加尾信號(hào)。結(jié)構(gòu)基因的最后一個(gè)外顯子中有一個(gè) AATAAA 的保守序列，此位點(diǎn) down－stream 有一段GT 或 T 富豐區(qū)，這2部分共同構(gòu)成 poly（A）加尾信號(hào)。

質(zhì)粒圖譜上有的箭頭順時(shí)針有的箭頭逆時(shí)針，那其實(shí)是代表兩條 DNA 鏈，即質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA，它的啟動(dòng)子等在其中一條鏈上，而它的抗性基因在另一條鏈上 .根據(jù)表達(dá)宿主不同，構(gòu)建時(shí)所選擇的載體也會(huì)不同。

二、目的基因的獲得

一般來說，目的基因的獲得有三種途徑：

調(diào)取基因：根據(jù)目的基因的序列，設(shè)計(jì)引物從含有目的基因的cDNA中通過PCR的方法調(diào)取目的基因，鏈接到克隆載體挑取單克隆進(jìn)行測序，以獲得想要的基因片段，這種方法相對(duì)成本較低，但是調(diào)取到的基因往往含有突變，還有不同基因的表達(dá)豐度不同，轉(zhuǎn)錄本比較復(fù)雜，或是基因片段很長，這些情況都很難調(diào)取到目的基因。

全基因合成：根據(jù)目的基因的DNA序列，直接設(shè)計(jì)合成目的基因。此方法準(zhǔn)確性高，相對(duì)成本會(huì)高一些，個(gè)人操作比較困難，需要專業(yè)的合成公司完成。優(yōu)點(diǎn)是可以合成難調(diào)取及人工改造的任何基因序列，同時(shí)可以進(jìn)行密碼子優(yōu)化，提高目的基因在宿主內(nèi)的表達(dá)量。

三、克隆構(gòu)建

目前，克隆構(gòu)建的方法多種多樣，除了應(yīng)用廣泛的酶切鏈接以外，現(xiàn)在還有很多不依賴酶切位點(diǎn)的克隆構(gòu)建方式。下面具體說一下雙酶切方法構(gòu)建載體的步驟。