慢病毒包裝與濃縮Protocol
慢病毒（ Lentivirus ）載體是以 HIV-1 （人類免疫缺陷 I 型病毒）為基礎發展起來的基因治療載體，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。通過包裝的慢病毒載體能夠產生表達 shRNA 的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵以及分化的后代細胞中表達 shRNA，被廣泛地應用于表達 RNAi 的研究中。
慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質粒可提供所有的轉錄并包裝shRNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質粒同時共轉染細胞，在細胞中進行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進入到宿主細胞之后，經過反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。實現在多種類型的細胞和轉基因小鼠中特異而穩定的基因表達的功能性沉默，為在原代的人和動物細胞組織中快速而效率高地研究基因功能，以及產生特定基因表達降低的動物提供了可能性。
一：慢病毒包裝過程
1.293細胞密度接近90%左右時進行傳代，加入37℃預熱的胰酶進行消化，將消化離心混勻后的細胞種于10mm培養皿。將細胞置于含5％CO2的37℃溫箱中孵育24h,當細胞貼壁后所占面積達到培養皿總面積的50％以上時轉染慢病毒質粒。
2.取兩個無菌1.5mlEP管，分別加入200μl無血清DMEM，其中一個EP管內加入1.5μg含有目的基因的病毒載體核心質粒和1.5μg病毒包裝質粒，病毒包裝質粒可按照pMDL:VSVG:REV=5:3:2比例加入；另一個EP管中加入6μl lipo2000。
3.靜止5分鐘。然后將兩管充分混勻，靜置15-20min。
4.將步驟3中的混合液逐滴加入細胞培養皿中，輕輕搖動平皿混勻，然后置于含5％CO2的37℃溫箱孵育。
4. 10h-16h后吸去培養基，加入適量37℃預熱的完全培養基，繼續將細胞放置溫箱孵育。
5.轉染后24h、48h、72h左右收集含慢病毒的上清。1500rpm離心五分鐘。
6.將待轉染的實驗細胞平鋪于35mm培養皿，12-24h后換液，較佳密度為30%－50％。第一次加入轉染后24h收集的病毒液培養。可根據情況進行病毒液的再次感染。細胞長滿后傳代或者檢測表達。
如果一次包裝的病毒液體積較大，可以通過PEG8000進行慢病毒液的濃縮，PEG 是環氧乙烷和水縮合而成的水溶性非離子型聚合物， 多用于濃縮病毒。
二：慢病毒濃縮過程
1. 配制5X PEG8000：
NaCl 8.766 g;
PEG8000 50g；
200ml Milli-Q純水；
溶解后將液體至于121℃ 高溫滅菌30min；將滅菌后母液保存在4℃。
2. 使用0.45μm濾頭過濾轉染后24h、48h、72h左右收集含慢病毒的上清液；
3. 每30ml過濾后的病毒初始液，加入5X PEG-8000 NaCl母液7.5 ml；
4. 每20～30min混合一次，8字搖勻，共進行3-5次；
5. 4℃放置過夜；
6. 4℃，4000 g，離心 20min
7. 吸棄上清，靜置管子1～2min，吸走殘余液體；
8. 加入適量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀；
9.將溶解病毒懸液分裝，儲存在-80 ℃，按需取用。
