毛細血管內皮細胞培養實驗

原理

毛細血管內皮細胞在形態上與心血管系統其它部位內皮細胞相似，但實驗證明，在生物學性狀上卻大不相同，不能相互代替，因此必須單獨進行培養。毛細血管細小，結構簡單，內皮細胞外有較多的結締組織，進行分離培養有很大困難。近年毛細血管培養已獲成功；材料取自血管豐富組織，利用人的小兒包皮、人脾臟、牛腎上腺、癌組織（如卵巢癌）等均可。

材料與儀器

小鼠 細胞
胰蛋白酶 Eagle 血清 膠原酶
培養瓶 離心機 濾膜

步驟

一、材料

1.  腫瘤條件培養基制備
 

（1）取C3H小鼠的S-180 實體肉瘤組織；

（2）胰蛋白酶消化，Dulbecco改良Eagle氏培養液15 ml（含10 %小牛血清），接種到T-75 Falcon產培養瓶中培養；

（3）在細胞生長接近完全匯合時，收集培養液制成條件培養基；再用含10 %小牛血清的新培養液后，也每隔兩天收集一次，可獲多量條件培養基；

（4）4000 轉/分，離心后，再通過0.22 μm微孔濾膜濾過，-20 ℃凍存備用（臨用前融解）。

2.  凝膠底層制備

（1）取60 mm Falcon產培養皿，加1 %Difco產明膠（用不含鈣和鎂的Hanks液配制），鋪蓋瓶底，形成薄層；

（2）置4 ℃過夜；用前再用不許培養液沖洗一次。

二、初代培養

（1）取材

取新鮮牛腎上腺數個，先用Hanks液洗除血污；

（2）剝除被膜，分離出皮質，切成1 立方毫米小塊，加0.5 %膠原酶室溫中消化1 小時；每隔10 分鐘用吸管吹打懸液令消化充分；

（3）通過不銹鋼紗網濾過，網眼要求只允許能通過小于110 微米長的毛細血管小段；

（4）650 rpm，4 ℃，離心7 分鐘后，棄掉上清膠原酶；

（5）沉淀物用培養液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩次；

（6）末次沉淀物仍用含10 %小牛血清的Dulbecco改良Eagle 氏培養液重懸后，稍吹打；

（7）接種入鋪有明膠底層的培養皿中，37 ℃培養；在培養頭1~3 小時中，毛細血管小段和內皮細胞最先貼附于底物上，而腎上腺細胞和成纖維細胞卻仍在培養液中漂浮；

（8）趁此時，吸除培養液，再加入腫瘤條件培養液；每兩天換液一次。毛細血管小段一般成自1~4 個內皮細胞，以后每個小段在底物上慢慢展成特殊形態的細胞島，能持續2~5 天。

三、毛細血管內皮細胞分離培養

毛細血管細胞初代培養細胞往往雜有其它非內皮細胞成分，此時需進一步純化。原理與培養腫瘤細胞時排除成纖維細胞類似，可采用機械刮除法。但刮除其它細胞后，剩余毛細血管內皮細胞島有時數量很少，此時細胞很給生長增殖，需用特殊飼細胞法等才易成功。

（1）初代培養2~3 天后，鏡下確認幾個毛細血管內皮細胞島，在培養皿背面，用不脫色筆劃圈圈起；

（2）鏡下檢查，如圈內殘有非內皮細胞時，可用顯微細針在倒置顯微鏡下挑除；此操作用細胞解剖器或用手操做均可，宜在凈化臺無菌氣流中、打開培養皿蓋進行，但時間不宜過長（15~20 分鐘）；圈外非內皮細胞可用無菌膠刮刮除；

（3）用培養液漂洗兩次，以去除漂浮細胞；

（4）剩余內皮細胞島如小（5~20 個細胞）而少時，生長增殖常變得緩慢或完全不生長，此時需加入3T3 等飼細胞；飼細胞接種量為4000 細胞/cm3；

（5）當內皮細胞充滿所有飼細胞空間后，用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養基；

（6）接種入明膠底物皿中繼續培養（飼細胞死亡命被淘汰），細胞增殖生長匯合后，按1：5 傳代。