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表皮細胞培養實驗
發布日期:2024-09-04 08:40:37


表皮細胞培養實驗


原理

利于皮膚表皮細胞培養成功的因素有,在有膠原的底物上易生長;另有人發現把人或小鼠表皮細胞培養在以3T3 細胞為飼養層(用射線照射后)上時,細胞易生長并可發生一定程度的分化現象。降低pH、Ca2+的含量和溫度等,均利于表皮細胞生長。向培養基中加氫化可的松( 10 μg/ml )、10-10 的霍亂毒素、10M-6 的異丙基腎上腺素(Isopro-terenol)和10 ng/mI 促表皮生長因子(EGF)能促表皮細胞生長。


材料與儀器

皮膚 血清
EDTA 胰蛋白酶 Eagle
血管鉗 吸管 CO2溫箱


步驟

皮膚是皮表細胞培養來源,小兒包皮是皮膚表皮細胞培養的好材料。全皮培養時,表皮細胞與成纖維細胞混合生長,難以純化。黑木登志夫(1981)用皮膚表皮和真皮分離培養法可獲純上皮細胞,有一定參考價值,其法如下:

 

1.  取材
取外科植皮或手術殘余皮膚小塊,以角化層薄者為佳,早產流產兒皮膚更好,切成 0.5~1 平方厘米小塊;


2.  EDTA處理
先置入0.02 %EDTA 中室溫置5 分鐘;


3.  冷消化
換入0.25 %胰蛋白酶中,置4 ℃過夜;


4.  分離
取出皮塊,用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開;


5.  溫消化
取出表皮單獨處理,用剪刀剪成更小的塊后,置入新的0.25 %胰蛋白酶中,37 ℃再消化30~60 分鐘;


6.  用吸管輕輕反復吹打,使成細胞懸液;


7.  培養液
通過80 目不銹鋼紗網濾過后,低速離心,吸上清,直接加入Eagle液和 20 %小牛血清,制成細胞懸液,接種入碟皿中,CO2溫箱培養。

注意事項

冷消化目的在于使表皮和真皮結合松散,如冷消化后分離下來的表皮膜自身也已松散,此時亦可直接置入PBS中用吸管吹打制備細胞懸液;不再經過第二次消化。


常見問題

皮膚表皮培養亦可用全皮消化法或組織塊培養法培養。用膠原酶消化為好,它對結締組織有較強消化作用,對表皮細胞損傷小,但成纖維細胞易與上皮細胞同時生長,在這種情況下,需做排除成纖維胞處理。血清中含有血小板來源的生長因子(PDGF),易促成纖維細胞的生長;如用好的、不含PDGF的無血清培養基培養可能更好。

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