蛋白質(zhì)的短暫表達實驗
材料與儀器
載體
牛血清 DMEM 葡聚糖 PBS DMSO EDTA
培養(yǎng)皿 培養(yǎng)箱 相差顯微鏡 離心機
步驟
1. 將目的基因亞克隆至合適的載體中得到所需的重組DNA，用小量法（5 ml 培養(yǎng)物）或用CsCl/溴化乙錠離心法純化重組DNA。
2. 將在DMEM-10 CS中生長匯片的COS-7細胞（每100 mm 培養(yǎng)皿約細胞）在轉(zhuǎn)染的前一天以1：5的比例分瓶，這樣第二天細胞將長至約50%匯片的程度，讓細胞在 CO2培養(yǎng)箱中于37℃生長過夜至約50%匯片。
3. 使用前（相應于待轉(zhuǎn)染的每一個100 mm 平皿的COS細胞）將55 ml 37℃的DMEM-10 NS 培養(yǎng)液與5~10 μg 重組DNA徹底混勻，再加入0.2 ml 葡聚糖/氯喹溶液，混勻。
4. 吸出COS細胞的培養(yǎng)液，向每一個100 mm 平血加入步驟3制備的DMEM-10 CS/DEAE-葡聚糖/DNA。在CO2培養(yǎng)箱中，37℃溫育細胞3~4 h（可能需要優(yōu)化），用相差顯微鏡觀察細胞。
5. 吸出DMEM/DEAE-葡聚糖/DNA，加入5 ml 10%DMSO（用PBS配制），室溫溫育細胞2 min。吸出DMSO并加入10 ml DMEM-10 CS。讓細胞在培養(yǎng)箱中于37℃ 生長過夜（12~20 h）。
6. 將毎個100 mm 平皿中轉(zhuǎn)染的COS細胞傳代至兩個新的100 mm 平血。按步驟7a或 7b于37℃溫育細胞。
7a. 當表達分泌蛋白時，在完成步驟6后96 h，加入5 ml DMEM-10CS并培養(yǎng)4天。收獲培養(yǎng)液，室溫下以約1 000 g 離心10 min，除去死細胞和碎片，保留上清液，用代謝標記、免疫沉淀、免疫親和層折、放射免疫、免疫印跡或生物學鑒定來檢測分泌蛋白質(zhì)。
7b. 當表達細胞表面蛋白或細胞內(nèi)蛋白時，按步驟5轉(zhuǎn)染后72 h，從細胞中吸出培養(yǎng)液。加 入5 ml PBS，搖晃洗滌，吸出PBS。加入5 ml 溶于PBS中的0.5 mmol/l EDTA，在COS培養(yǎng)箱中37℃保溫15 min。用巴斯德吸管輕輕移出培養(yǎng)皿中的細胞，采用合適的 熒光抗體使細胞表面蛋白染色，通過顯微鏡或流式細胞儀檢測。
