發酵過程中無機磷的利用
實驗原理
酵母能使蔗糖和葡萄糖發酵產生乙醇和二氧化碳。此過程與無機磷將糖磷酸化有關。
本實驗利用無機磷與鉬酸形成的磷鉬酸絡合物能被還原劑α－1，2，4－氨基萘酚磺酸鈉還原成鉬藍的原理來測定發酵前后反應混合物中無機磷的含量，用以觀察發酵過程中無機磷的消耗。
試劑 和器材
試劑
蔗糖；5％三氯乙酸；3mol/L硫酸和2.5％鉬酸銨等體積混合液。
磷酸鹽溶液：稱取Na 2 HPO 4 ·12H 2 O 120.7g(或Na 2 HPO 4 ·2H 2 O 60g)和KH 2 PO 4 20g溶解于
蒸餾水中，定容至1000mL，在冰箱中貯存備用。臨用前稀釋適當倍數。
標準磷酸鹽溶液：將磷酸氫二鉀（KH 2 PO 4 ）在110℃烘箱中烘干2小時，冷卻后準確稱取0.1098g，用蒸餾水溶解，定容到1000 mL，成為每毫升溶液含25μg無機磷的標準磷酸鹽溶液。
α－1，2，4－氨基萘酚磺酸溶液：將0.25gα－1，2，4－氨基萘酚磺酸，15g亞硫
酸氫鈉及0.5g亞硫酸鈉溶于100 mL 蒸餾水中。使用前稀釋三倍。
二、材料
新鮮啤酒酵母。
三、器材
試管 1.5×15cm（×15）；移液管0.2mL（×2），0.5mL（×2），1mL（×2），5mL（×3）；錐形瓶50mL（×1）；水浴鍋；研缽；濾紙；分光光度計。
操作方法
一、制作標準曲線
取9支 試管 編號后，按下表順序加入試劑：
管號 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
標準磷酸鹽溶液(mL) | 0 | 0.2 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 |
含磷量(μg) | 0 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 |
蒸餾水(mL) | 3.0 | 2.8 | 2.6 | 2.4 | 2.2 | 2.0 |
鉬銨酸－硫酸混合液(mL) | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
α－1，2，4－氨基萘酚磺酸鈉溶液(mL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
充分混勻后，37℃ 水浴 保溫10min | ||||||
A600 | ||||||
繪制標準曲線：以 A600 為縱坐標，含磷量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。
二、酵母發酵
稱取2 ~ 4g新鮮酵母和1g蔗糖，放入研缽內仔細研碎。加入5mL蒸餾水和5mL磷酸鹽溶液研磨均勻。將勻漿轉移至50mL 錐形瓶中并立即取出0. 5mL均勻的懸浮液，加入到已盛有3.5mL三氯乙酸溶液的試管中，搖勻作為試樣1。將錐形瓶放入37℃恒溫 水浴 中，每隔30分鐘取出0. 5mL懸浮液，立即加入已盛有3. 5mL三氯乙酸溶液的試管中，搖勻。共取三次，作為試樣2，3，4。將每個試樣過濾后，得無蛋白濾液備用。
三、無機磷的測定
取五只干燥潔凈的試管，編號后按下表加入各種溶液：
管號 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
發酵時間(min) | 0 | 30 | 60 | 90 | — |
無蛋白濾液(mL) | 0.1 | 0.1 | 0.1 | 0.1 | — |
蒸餾 水(mL) | 2.9 | 2.9 | 2.9 | 2.9 | 2.9 |
鉬銨酸－硫酸混合液(mL) | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
α－1，2，4－氨基萘酚磺酸鈉溶液(mL) | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
充分混勻后，37℃水浴保溫10min | |||||
A660 | |||||
從標準曲線上查處各試樣的無機磷含量，以試樣1的無機磷含量為100％，計算酵母發酵30、60和90分鐘后消耗無機磷的相對百分數。
注意事項
在本實驗的預備實驗中，應首先摸索酵母的用量及磷酸鹽的稀釋倍數。使光吸收值在適當的范圍內。
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