嗅鞘細胞的原代培養實驗
原理
嗅鞘細胞是在功能上介于施萬細胞和少突膠質細胞之間的一種特殊膠質細胞，是決定嗅神經元軸突終生再生的關鍵因素。它具有神經營養、抑制膠質增生、瘢痕形成、成鞘等作用，為軸突生長提供了適宜的微環境及較強的遷移特性，已成為促進中樞神經再生的理想候選細胞之一。基于其與成纖維細胞貼壁能力的不同，目前我們常采用差速貼壁法獲得大量高純度的嗅鞘細胞。
材料與儀器
2月齡成年大、小鼠
含20%胎牛血清的DF12培養基 D-hanks液 消化液(0.25%胰蛋白酶+0.04%的EDTA) 25μg ml多聚賴氨酸
培養瓶
步驟
1動物斷頭處死后，暴露嗅球，無菌條件下摘取雙側嗅球，棄除軟腦膜，在鏡下仔細剝取嗅神經纖維層及嗅小球層。將取得的組織剪成約1mm3大小，用D-hanks液清洗2次后，0.125%胰蛋白酶37℃分離消化25min,然后浸入含有20%血清的培養液中終止消化8min,吸出組織，用無血清的DF12培養基清洗1次。最后依照總論的方法用含20%胎牛血清的DF12培養基將其制成單細胞懸液。
2.將吹打好的單細胞懸液置于未經處理的培養瓶中，37℃,5%CO2孵箱中培養18h后，將未貼壁的細胞懸液轉種于另一未經包被處理的培養皿中，37℃,5%CO2繼續培養36h后重復以上操作，最后將未貼壁細胞按照合適的密度接種于經25μg/ml多聚賴氨酸包被的培養器皿中。
3.前3d按1/3量換液，以后每隔2d 1/2量換液（含10%胎牛血清的DF12培養液），37℃,5%CO2培養5-10d。嗅鞘細胞在接種24h后大部分已經貼壁，呈不規則顆粒樣，胞體折光性較差。培養3d,偶有胞體呈現錐形或紡錘形的細胞，發出短小突起，可見蹼狀生長的錐樣結構，細胞周圍碎片物質減少（圖I-7A)。常規培養5d,大部分細胞胞體呈扁平樣，胞漿向外延伸，發出短小、蹼狀突起。10d后少數為多極星形膠質細胞樣，大部分細胞呈雙極、三極施萬細胞樣，胞體立體感強，伸出長而纖細、柔軟的突起彼此交織成網絡狀（圖l-7B、C)。另有一些細胞胞體較大，扁平樣，邊緣不規則，立體感較差。
注意事項
1嗅鞘細胞位于嗅球表面兩層即嗅神經層和小球層，嗅球每層結構間的差別并不十分明顯，即使是在解剖顯微鏡下取材也難以絕對完整地分離。因此，培養物中可能混有某些雜細胞，主要為來自于血管、軟腦膜等結締組織的成纖維細胞，也可見少量星形膠質細胞、小膠質細胞、神經元等。顯微鏡下取材應盡可能仔細地清除外層的軟腦膜，可顯著減少成纖維細胞的數量。
2.原代培養的成年動物嗅鞘細胞的初始形態較為特殊，呈不規則顆粒樣，似“煎蛋”形或花朵狀。初學者常誤為培養失敗，建議耐心觀察5-7d后，就會發現細胞逐漸呈典型形態。
3.目前嗅鞘細胞的純化多采用經典的差速貼壁法，此法與施萬細胞的差速純化有所不同。施萬細胞是在體外基質上分化成熟后才實施純化，而嗅鞘細胞則利用其在原代取材培養早期時各種細胞貼壁能力的不同而將其純化分離。
常見問題
1由于成年大鼠嗅球中星形膠質細胞成分較少，且在此培養條件下難以存活，因此筆者通常選用單次差速貼壁，即單細胞懸液置于未經處理的培養瓶中培養18-24h,去除主要污染成纖維細胞后便可獲得既有較高產率又保持較高純度的嗅鞘細胞。
2.體外培養的嗅鞘細胞形態因供體動物年齡、取材部位和培養條件的不同而有所差異。同時筆者觀察到，成年小鼠的嗅球嗅鞘細胞胞體較大鼠的略小，大鼠嗅鞘細胞發出的突起粗大、平直，而小鼠的則纖細、柔軟，提示這可能與種屬差異也有關。
