小腦顆粒神經元的原代培養實驗
原理
小腦顆粒神經元的體外培養受取材部位、特殊培養條件等因素的影響，易于獲得純度較高的培養物。該細胞為雙極突起，常用來研究神經突起的生長。其培養條件具有高濃度鉀離子依賴特性，常用來作為誘導神經元凋亡的研究模型。當成熟顆粒神經元的培養液由高KCl(通常是25-30mmol/L)換為低KC!(基本培養液中已含5mmol/L KCl)時，細胞會逐漸發生凋亡。
材料與儀器
新生7d的SD大鼠仔鼠
10%胎牛血清+DMEM Neurobasal+B27 KCl
培養瓶
步驟
原代培養來自于新生7d的SD大鼠小腦顆粒神經元，可參考Moreno-Flores的方法，此方法培養的小腦顆粒神經元純度達到95%以上。具體操作過程如下。
1.首先依照總論的方法獲得細胞懸液，然后在離心獲得的細胞沉淀中，加入少量的完全培養液(Neurobasal+B27+25mmol/L KCl)重懸細胞，再根據細胞計數的結果補加適最的完全培養液。根據培養目的按照合適的密度接種細胞于多聚賴氨酸包被的介質上，37℃,5%CO2的孵育箱內培養。
2.細胞培養第4天1/2量換液，至第7天細胞基本成熟。小腦顆粒神經元胞體小，接種后約24h,開始伸出突起，突起易成束生長。圖I-2示接種48h后細胞生長情況。
注意事項
1.在原代取材時，由于取材部位和仔鼠體積的原因，通常將消過毒的仔鼠放置在100mm玻璃皿中，直接用解剖器械取出完整的小腦，不做斷頭處理。
2.小腦的腦膜不易剝離干凈，要特別仔細去除，否則培養物中成纖維細胞的污染難以去除。
3.由于培養細胞的目的不同，接種時的密度就有區別。如用于神經突起觀察，可接種(1-3)x105/cm2的密度；如用于凋亡誘導的研究，可接種(4-6)x105/cm2的密度。
4.在做凋亡誘導時，通常將含高鉀的培養液全量換液為不含額外添加KCl的普通Neurobasal+B27培養液即可。按照核固縮判斷的方法，8h后凋亡的細胞數量可達40%左右。
常見問題
1小腦顆粒神經元胞體小，突起細長，且容易成束生長，個人感覺該細胞可做突起生長的大致觀察，并不適合利用軟件分析突起長短。神經元一般3-4d突起就可長好，可開始觀察。
2.在體外培養7d左右待細胞成熟后，可以開展凋亡實驗。如添加保護劑抑制凋亡，應注意誘導凋亡的時間不可過長，否則可能導致保護實驗失敗。
