超氧化物歧化酶（SOD）濃度測定
簡介
小鼠 SOD 測定采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。通過雙抗體一步夾心法，在包被 SOD 抗體的 96 孔板中，加入標本、標準品、HRP 標記的檢測抗體，通過恒溫培養箱溫育并徹底洗滌。
加入底物 TMB 顯色，TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的 SOD 正相關，用酶標儀在 450 nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。
材料與儀器
試驗樣品、移液槍、酶標儀、恒溫培養箱、小鼠超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 檢測試劑盒等。
步驟
1、樣品收集及處理
小鼠血清：使用不含熱源和內毒素的試管，收集血液后，于 3 000 rpm/min 離心 10 分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
血漿：用肝素鈉潤濕潔凈的 EP 管，收集血液，3 000 rpm/min 離心 10 分鐘后，小心收集上清。
組織勻漿：取小鼠組織，加入適量生理鹽水搗碎，3 000 轉離心 10 分鐘取上清。
細胞培養上清：1）檢測分泌型因子，收集細胞上清，2 000~3 000 rpm/min 離心 20 分鐘后收集上清；2）檢測細胞內的因子，用液氮反復凍融細胞促使細胞破壞并釋放出細胞內因子。2 000~3 000 rpm/min 離心 20 分鐘，收集上清。
如不及時檢測，凍存于 -20 ℃ 時，要檢測時在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
2、試劑盒保存
小鼠超氧化物歧化酶（SOD）ELISA 檢測試劑盒保存在 2~8 ℃，使用前室溫平衡 20 分鐘。
3、試劑準備
按試劑盒說明書配制洗滌緩沖液按 1 :20 稀釋，即 1 份 20 x 洗滌緩沖液加 19 份的蒸餾水。
4、檢測步驟
1）將室溫平衡 20 min 后板條取出，剩余自封袋密封放回 4 ℃。
2）設置標準品孔、樣本孔和空白孔，標準品孔各加不同濃度的標準品 50 μL。
3）若檢測因子在樣本含量過高，則需要稀釋樣本，即樣本孔先加待測樣本 10 μL，再加樣本稀釋液 40 μL；若否，則樣本孔先加待測樣本 50 μL。空白孔不加。
4）除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入 HRP 標記的檢測抗體 100 μL，用封板膜封住反應孔，37 ℃ 封恒溫箱溫育 1 h。
5）棄去液體，在吸水紙上拍干并加洗滌液，靜置 1 min，甩去洗滌液后拍干，重復洗板 5 次。
6）每孔加入底物 A、B 各 50 μL，37 ℃ 避光孵育 15 min。
7）每孔加入終止液 50 μL，15 min 內，在 450 nm 波長處測定各孔的 OD 值。
5、結果判斷
繪制標準曲線，以標準品濃度作橫坐標，對應 OD 值做縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。
注意事項
1. 樣品準備時離心速度大，導致溶血。
2. 檢測試劑盒未在室溫完全溶解后就使用。
3. 未按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
4. 液體試劑使用前未充分搖勻。
