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中國(guó)微生物菌種

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α 突觸核蛋白超聲處理實(shí)驗(yàn)操作步驟(適用于 tau, Aβ 等其他活性蛋白)
發(fā)布日期:2024-10-17 16:15:29


α 突觸核蛋白超聲處理實(shí)驗(yàn)操作步驟(適用于 tau, Aβ 等其他活性蛋白)


材料與儀器

材料:超聲管

儀器:通風(fēng)櫥、非接觸式超聲波破碎儀或探頭超聲波儀(帶 1/8”尖端的超聲儀)

步驟

超聲前后準(zhǔn)備 PFF 的步驟:

1. 收到原纖維后,立即將它們儲(chǔ)存在 -80℃。

2. 提前計(jì)劃好需要嘗試的超聲處理設(shè)置和原纖維的量以便實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。

3. 37℃ 下解凍超聲實(shí)驗(yàn)所需的原纖維的量。

4. 分裝到多個(gè)超聲管中,并按之前計(jì)劃好的在不同的時(shí)間和設(shè)置下對(duì)它們進(jìn)行超聲處理。

5. 通過(guò)電鏡(EM) 查看上述經(jīng)過(guò)超聲處理的樣品,尋找纖維尺寸分布為 ~50nm 的樣品,記錄為最佳超聲處理設(shè)置。

6. 解凍未超聲處理的原纖維(收到后儲(chǔ)存在 -80℃ 的原纖維)。

7. 在開(kāi)始實(shí)驗(yàn)之前在最佳超聲處理設(shè)置下進(jìn)行超聲處理(為達(dá)到最好實(shí)驗(yàn)效果,我們建議是在進(jìn)行超聲處理后立即使用,但如果工作流程不允許,替代方法是:在最佳超聲處理設(shè)置下進(jìn)行超聲處理,等分到所需劑量(體積) ,冷凍等分試樣以備后用。然后他們可以在注射前根據(jù)需要解凍超聲處理的等分試樣)。

 

非接觸式超聲波破碎儀操作設(shè)置:

使用 1.5mL 微量管(Microtubes)加蓋,至少 100uL 樣本體積(建議 100-300uL),30 秒開(kāi), 30 秒停, 5 個(gè)高頻循環(huán)。(注:儀器頻率/功率范圍為 20-60kHz 和 25-210 瓦。) 

我們建議在較高濃度下進(jìn)行超聲處理,然后再進(jìn)行稀釋。超聲處理會(huì)增加材料的溶解度和均勻性,因此超聲處理之后再移液和稀釋會(huì)更準(zhǔn)確。

由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境還有儀器的不同,并沒(méi)有一個(gè)一勞永逸的黃金法則,最好的選擇是使用您現(xiàn)有的超聲儀根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)需求優(yōu)化超聲處理方案。可以通過(guò)沉降分析尋找大部分原纖維變得可溶的超聲參數(shù),或使用 AFM/TEM 確定原纖維長(zhǎng)度<50nm 的超聲參數(shù)。

 

探頭超聲波儀操作步驟(改良自 Michael J Fox 機(jī)構(gòu))

在通風(fēng)櫥或生物安全柜中執(zhí)行所有超聲處理的步驟。確保通風(fēng)柜采用外部管道,不會(huì)將廢氣再循環(huán)到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。

1.在 37℃ 下解凍足量的 5mg/mL PFF 然后立即使用。建議再次測(cè)量蛋白質(zhì)濃度,因?yàn)閮鋈诳赡軙?huì)改變蛋白質(zhì)濃度。

2.將 PFF 添加到含有適當(dāng)體積的無(wú)菌 dPBS 的無(wú)菌微量離心管中,將 PFF 稀釋至所需濃度。(注:對(duì)于小鼠注射,我們通常使用 2-2.5mg/mL 的 PFF。)

3.使用探針超聲儀,以 2 檔功率超聲處理總共 60 個(gè)脈沖(每次約 0.5 秒)。在每 10-12 個(gè)脈沖之間暫停一下,以防止溶液過(guò)度加熱并避免起泡。

 

注意事項(xiàng)

我們還使用高能水浴超聲波儀測(cè)試了該操作步驟,到目前為止的結(jié)果表明該步驟也適用于對(duì) PFF 進(jìn)行超聲處理。水浴超聲波儀可以對(duì)封閉管進(jìn)行超聲處理,對(duì)于這種可能生成危險(xiǎn)氣溶膠的操作比較安全。然而,當(dāng)使用浴式超聲處理代替探頭超聲處理時(shí),同樣需要確認(rèn)原纖維在 ≤ 50nm 的長(zhǎng)度,以達(dá)到合適的毒性。

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