低至單拷貝核酸 qPCR 方案
簡介
熒光定量 PCR 技術可以實現 RNA 的相對定量,廣泛應用于分子生物學研究及疾病相關研究。QIAGEN QuantiNova PCR 系列可支持包括一步法、多重等多種 qPCR 應用;超快速的反應體系 30 min 即可完成實驗及獨特的顏色指示方案杜絕加樣錯誤;LNA(鎖核酸)技術加持增強引物或探針的靈敏度和特異性。
原理
QIAGEN QuantiNova PCR 系統中,獨特配方快速提高 qPCR 的反應速率,最快只需 10 s 即可完成退火及延伸步驟,30 min 即可完成實驗過程。
出色的檢測靈敏度,可對最低單拷貝靶標進行檢測,并能兼容跨越至少 8 個數量級(10 fg-100 ng)起始模板量,更加穩定、精準地應用于各種定量 PCR 應用。
獨特的顏色指示方案有效杜絕加樣的錯誤
LNA 技術加持,使得 qPCR 具備高度靈敏性和特異性,LNA能夠區分單核苷酸,以更短的序列達到較高的 Tm 值。因此,LNA 技術更適合用于 miRNA 的 qPCR 檢測。由于 miRNA 的長度僅有 22 nt 左右,序列同源性高,且不同 miRNA 之間 GC 含量差異較大,因此對其進行特異性檢測面臨著諸多挑戰,尤其是定量 PCR 檢測。針對這些挑戰,QIAGEN 的 miRCURY LNA PCR 系統基于 LNA 的更強的親和力,實現了以更短的序列達到較高的 Tm 值,不僅保障檢測的特異性,靈敏度也能得到顯著提升。此外,在同一檢測體系中檢測多個靶標時,通過引入 LNA 針對不同靶標引物的 Tm 進行調節,保障不同 GC 含量的 miRNA 能夠以較為均一的效率被擴增,從而提高 qPCR 檢測結果的準確性。
材料與儀器
QIAGEN QuantiNova PCR Kit 或 miRCURY LNA PCR Kit(miRNA 檢測)
離心機
混勻器
水浴箱或 PCR 儀
無 RNase 槍頭、8 連管或微孔板
超凈工作臺
核酸擴增儀
步驟
以 miRNA 的實時定量步驟為例:
1. 使用無 RNase 水將每個樣本的 RNA 模板稀釋至 5 ng/μl。
2.參照以下表在冰上制備逆轉錄反應。混勻后放在冰上。
3. 42℃ 孵育 60 min。
4. 95℃ 孵育 5 min 以加熱使逆轉錄酶失活。
5.立即冷卻至 4℃。
6. 將逆轉錄反應放在冰上,直接進行實時 PCR。
注:如不打算立即使用,請將未稀釋的 cDNA 在 2-8℃ 保存最多 4 天,或在-15℃—— -30℃保存最多 5 周。
7. 向 10μl RT 反應中加入 590 μl 無 RNase 的水,將 cDNA 稀釋 1:60。不建議儲存 1:60 稀釋的 cDNA。
8. 根據下表制備反應混合物。由于 PCR 反應的熱啟動,在反應設置或編程實時循環儀時,沒有必要將樣品保持在冰上。
<span~undefined關于 rox<="" span="" style="box-sizing: border-box; border: 0px solid; --tw-border-spacing-x: 0; --tw-border-spacing-y: 0; --tw-translate-x: 0; --tw-translate-y: 0; --tw-rotate: 0; --tw-skew-x: 0; --tw-skew-y: 0; --tw-scale-x: 1; --tw-scale-y: 1; --tw-pan-x: ; --tw-pan-y: ; --tw-pinch-zoom: ; --tw-scroll-snap-strictness: proximity; --tw-gradient-from-position: ; --tw-gradient-via-position: ; --tw-gradient-to-position: ; --tw-ordinal: ; --tw-slashed-zero: ; --tw-numeric-figure: ; --tw-numeric-spacing: ; --tw-numeric-fraction: ; --tw-ring-inset: ; --tw-ring-offset-width: 0px; --tw-ring-offset-color: #fff; --tw-ring-color: rgba(59,130,246,.5); --tw-ring-offset-shadow: 0 0 #0000; --tw-ring-shadow: 0 0 #0000; --tw-shadow: 0 0 #0000; --tw-shadow-colored: 0 0 #0000; --tw-blur: ; --tw-brightness: ; --tw-contrast: ; --tw-grayscale: ; --tw-hue-rotate: ; --tw-invert: ; --tw-saturate: ; --tw-sepia: ; --tw-drop-shadow: ; --tw-backdrop-blur: ; --tw-backdrop-brightness: ; --tw-backdrop-contrast: ; --tw-backdrop-grayscale: ; --tw-backdrop-hue-rotate: ; --tw-backdrop-invert: ; --tw-backdrop-opacity: ; --tw-backdrop-saturate: ; --tw-backdrop-sepia: ; line-height: 1.625rem !important;">染料的使用應注意:無需 ROX 染料的設備:Rotor-Gene?、Bio-Rad?CFX、Roche?LightCycler?480、Agilent?Technologies Mx 儀器;低濃度 ROX 染料:Applied Biosystems 7500、ViiA 7 和 QuantStudio Real-Time PCR Systems;高濃度 ROX 染料:ABI PRISM 7000、Applied Biosystems 7300 和 7900、StepOne Real-Time PCR Systems。當使用需要高 ROX 染料濃度的儀器時,ROX 參考染料一次反應中使用 20x 濃縮溶液。對于需要低 ROX 染料濃度的儀器,使用 200x 濃度。
9. 充分混合反應物,將 10μl 加入 PCR 管或 PCR 板孔中,或將 20 μl 加入 Rotor-Disc 100 中。
注意:此時可以暫停實驗。將反應物在 2℃-8°C 下避光保存 24 h。
10. 在室溫下對試管或平板進行短暫離心。
11. 根據下表對實時循環儀進行設置。
步驟 | 時間 | 溫度 |
熱啟動 | 2 min | 95°C |
DNA 的復制和擴增 | ||
變性 | 10 s | 95°C |
退火/延伸 | 60 s | 56°C |
循環數 | 40 | |
熔解曲線分析 | 60–95°C |
注:數據采集應在退火/延伸步驟中進行。
12. 將 PCR 試管或平板放入實時循環儀中,啟動循環程序。
13. 使用實時 PCR 儀器附帶的軟件進行初始數據分析,以獲得原始 Cq 值(Cp 或 CT,取決于 PCR 儀器)。
注意事項
1. miRCURY SYBR?Green PCR Master Mix 和 ROX 參比染料也可以在 2℃-8oC 避光保存長達 12 個月。
2. 對于高表達的 miRNA,可以使用低至 10pg 的總 RNA 作為起始量。對于弱表達的 miRNA,建議使用高達 200 ng 的總 RNA。
3. 在冰上解凍 RNA 和 5x miRCURY RT SYBR 綠色反應緩沖液。室溫下解凍不含 RNase 的水。
4. 用離心機收集引物管等側面的殘余液體,然后在冰上保存。
5. 在進行反轉錄操作時,應在冰上加樣,以最大限度地降低 RNA 降解的風險。