低至單拷貝核酸 qPCR 方案

簡介

熒光定量 PCR 技術可以實現 RNA 的相對定量，廣泛應用于分子生物學研究及疾病相關研究。QIAGEN QuantiNova PCR 系列可支持包括一步法、多重等多種 qPCR 應用；超快速的反應體系 30 min 即可完成實驗及獨特的顏色指示方案杜絕加樣錯誤；LNA（鎖核酸）技術加持增強引物或探針的靈敏度和特異性。

原理

QIAGEN QuantiNova PCR 系統中，獨特配方快速提高 qPCR 的反應速率，最快只需 10 s 即可完成退火及延伸步驟，30 min 即可完成實驗過程。

出色的檢測靈敏度，可對最低單拷貝靶標進行檢測，并能兼容跨越至少 8 個數量級（10 fg-100 ng）起始模板量，更加穩定、精準地應用于各種定量 PCR 應用。

獨特的顏色指示方案有效杜絕加樣的錯誤

LNA 技術加持，使得 qPCR 具備高度靈敏性和特異性，LNA能夠區分單核苷酸，以更短的序列達到較高的 Tm 值。因此，LNA 技術更適合用于 miRNA 的 qPCR 檢測。由于 miRNA 的長度僅有 22 nt 左右，序列同源性高，且不同 miRNA 之間 GC 含量差異較大，因此對其進行特異性檢測面臨著諸多挑戰，尤其是定量 PCR 檢測。針對這些挑戰，QIAGEN 的 miRCURY LNA PCR 系統基于 LNA 的更強的親和力，實現了以更短的序列達到較高的 Tm 值，不僅保障檢測的特異性，靈敏度也能得到顯著提升。此外，在同一檢測體系中檢測多個靶標時，通過引入 LNA 針對不同靶標引物的 Tm 進行調節，保障不同 GC 含量的 miRNA 能夠以較為均一的效率被擴增，從而提高 qPCR 檢測結果的準確性。

材料與儀器

QIAGEN QuantiNova PCR Kit 或 miRCURY LNA PCR Kit（miRNA 檢測）

離心機

混勻器

水浴箱或 PCR 儀

無 RNase 槍頭、8 連管或微孔板

超凈工作臺

核酸擴增儀   

步驟

以 miRNA 的實時定量步驟為例：

1. 使用無 RNase 水將每個樣本的 RNA 模板稀釋至 5 ng/μl。

2.參照以下表在冰上制備逆轉錄反應。混勻后放在冰上。

3. 42℃ 孵育 60 min。

4. 95℃ 孵育 5 min 以加熱使逆轉錄酶失活。

5.立即冷卻至 4℃。

6. 將逆轉錄反應放在冰上，直接進行實時 PCR。

注：如不打算立即使用，請將未稀釋的 cDNA 在 2-8℃ 保存最多 4 天，或在-15℃—— -30℃保存最多 5 周。 

7. 向 10μl RT 反應中加入 590 μl 無 RNase 的水，將 cDNA 稀釋 1:60。不建議儲存 1:60 稀釋的 cDNA。

8. 根據下表制備反應混合物。由于 PCR 反應的熱啟動，在反應設置或編程實時循環儀時，沒有必要將樣品保持在冰上。

<span~undefined關于 rox<="" span="" style="box-sizing: border-box; border: 0px solid; --tw-border-spacing-x: 0; --tw-border-spacing-y: 0; --tw-translate-x: 0; --tw-translate-y: 0; --tw-rotate: 0; --tw-skew-x: 0; --tw-skew-y: 0; --tw-scale-x: 1; --tw-scale-y: 1; --tw-pan-x: ; --tw-pan-y: ; --tw-pinch-zoom: ; --tw-scroll-snap-strictness: proximity; --tw-gradient-from-position: ; --tw-gradient-via-position: ; --tw-gradient-to-position: ; --tw-ordinal: ; --tw-slashed-zero: ; --tw-numeric-figure: ; --tw-numeric-spacing: ; --tw-numeric-fraction: ; --tw-ring-inset: ; --tw-ring-offset-width: 0px; --tw-ring-offset-color: #fff; --tw-ring-color: rgba(59,130,246,.5); --tw-ring-offset-shadow: 0 0 #0000; --tw-ring-shadow: 0 0 #0000; --tw-shadow: 0 0 #0000; --tw-shadow-colored: 0 0 #0000; --tw-blur: ; --tw-brightness: ; --tw-contrast: ; --tw-grayscale: ; --tw-hue-rotate: ; --tw-invert: ; --tw-saturate: ; --tw-sepia: ; --tw-drop-shadow: ; --tw-backdrop-blur: ; --tw-backdrop-brightness: ; --tw-backdrop-contrast: ; --tw-backdrop-grayscale: ; --tw-backdrop-hue-rotate: ; --tw-backdrop-invert: ; --tw-backdrop-opacity: ; --tw-backdrop-saturate: ; --tw-backdrop-sepia: ; line-height: 1.625rem !important;">染料的使用應注意：無需 ROX 染料的設備：Rotor-Gene?、Bio-Rad?CFX、Roche?LightCycler?480、Agilent?Technologies Mx 儀器；低濃度 ROX 染料：Applied Biosystems 7500、ViiA 7 和 QuantStudio Real-Time PCR Systems；高濃度 ROX 染料：ABI PRISM 7000、Applied Biosystems 7300 和 7900、StepOne Real-Time PCR Systems。當使用需要高 ROX 染料濃度的儀器時，ROX 參考染料一次反應中使用 20x 濃縮溶液。對于需要低 ROX 染料濃度的儀器，使用 200x 濃度。

9. 充分混合反應物，將 10μl 加入 PCR 管或 PCR 板孔中，或將 20 μl 加入 Rotor-Disc 100 中。

注意：此時可以暫停實驗。將反應物在 2℃-8°C 下避光保存 24 h。

10. 在室溫下對試管或平板進行短暫離心。

11. 根據下表對實時循環儀進行設置。

注：數據采集應在退火/延伸步驟中進行。

12. 將 PCR 試管或平板放入實時循環儀中，啟動循環程序。

13. 使用實時 PCR 儀器附帶的軟件進行初始數據分析，以獲得原始 Cq 值（Cp 或 CT，取決于 PCR 儀器）。

注意事項

1. miRCURY SYBR?Green PCR Master Mix 和 ROX 參比染料也可以在 2℃-8oC 避光保存長達 12 個月。

2. 對于高表達的 miRNA，可以使用低至 10pg 的總 RNA 作為起始量。對于弱表達的 miRNA，建議使用高達 200 ng 的總 RNA。

3. 在冰上解凍 RNA 和 5x miRCURY RT SYBR 綠色反應緩沖液。室溫下解凍不含 RNase 的水。

4. 用離心機收集引物管等側面的殘余液體，然后在冰上保存。

5. 在進行反轉錄操作時，應在冰上加樣，以最大限度地降低 RNA 降解的風險。