多孔塑料培養(yǎng)板單細胞克隆法

原理

多孔塑料培養(yǎng)板克隆細胞的主要過程是

1.  制備出1~2 細胞/毫升低密度的細胞懸懸液；

2.  向多孔塑料培養(yǎng)板各孔中分別接種細胞懸液0.5~1 ml，則每孔平均含1 個細胞。

3.  鏡下檢測每孔所含細胞數(shù)，標記下含單細胞的孔，置溫箱培養(yǎng)，數(shù)日后凡在已標記的孔中有生長增殖的細胞群即為克隆細胞。

材料與儀器

細胞
Hanks 培養(yǎng)液 胰蛋白酶
吸管 試管 吸管 計數(shù)器 培養(yǎng)板 加液器

步驟

1.  消化
取健康待克隆細胞，吸出瓶內(nèi)培養(yǎng)液，加消化液；

2.  低密度細胞懸液的制備
做克隆細胞時首先需先用消化法制備出分散成單個細胞懸液：然后稀釋細胞，使之成為1~2 細胞/毫升懸液；最適宜細胞密度為1~2 細胞/ml 培養(yǎng)液；

3.  接種
先用吸管輕輕吹打細胞懸液，使混懸均勻，繼用加樣器向塑料培養(yǎng)板每孔內(nèi)加0.5 毫升；接種時要迅速準確，爭取在最短時間內(nèi)加完，以免培養(yǎng)液蒸發(fā)，然后迅速蓋好蓋板，置CO2溫箱培養(yǎng)；

4.  標記
培養(yǎng)過6~12 小時后，待細胞下沉并貼附于培養(yǎng)板孔底后，從溫中取出，置倒置光顯微鏡臺上，觀察和標記下含單個細胞的孔，置CO2溫箱培養(yǎng)；CO2箱內(nèi)含有水槽，以保持箱內(nèi)濕度。

在培養(yǎng)中一般無需換液，只有在細胞增長過于緩慢時才可進行換液。換液時先吸除舊培養(yǎng)基，但不要吸除過多，余少許，以免細胞干涸。然后再迅速補加新鮮克隆培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)3~4 周。待孔內(nèi)細胞增至500~600 個時，可進行分離培養(yǎng)；

5.  分離擴大培養(yǎng)
培養(yǎng)86~96 小進后進行觀察。

挑選生長良好的單細胞克隆孔，先吸除舊培養(yǎng)液，用Hanks洗1~2 次，繼加胰蛋白酶少許，加入量以能覆蓋細胞群即可，如過多，應(yīng)吸除多余消化液。

置于倒置顯微鏡下窺視，待發(fā)現(xiàn)細胞變圓時，加入0.1 ml 含10 %血清地克隆培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打，當細胞離開底物懸浮后，一并吸入管內(nèi)，移入另瓶或皿中，再補加一定量克隆培養(yǎng)液，置CO2溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)、增量，使之形成新的細胞群體后，即轉(zhuǎn)用常規(guī)培養(yǎng)法培養(yǎng)。

注意事項

1.  觀察并挑選孔內(nèi)確實僅含有一個細胞后，才可進行標記。觀察時要特別注意孔底邊緣部位，如細胞落于該處，可能由于直角部折光而觀察不清，凡不能確認含一個細胞的孔者，不進行標記，以免發(fā)生假克隆。

2.  標記時要挑選含有健康細胞的孔（細胞體積適宜，輪廓清晰完整）。

3.  亦可接種到其它底物如碟皿中進行細胞克隆，但細胞易流動和克隆形成后不易分離。如僅為測定細胞克隆形成率，而不做單細胞分離，仍可用培養(yǎng)皿中培養(yǎng)法。