單細胞分離培養法

原理

從理論上說各種培養細胞都可用以進行克隆培養。但實際上，初代培養細胞和有限細胞系（二倍體細胞）比較困難。無限細胞系、轉化細胞系和腫瘤細胞等則比較容易。

其原因是，當體內任何細胞被置于體外培養后，對培養環境都有一個適應過程。期間細胞對營養液具有同化作用，即從培養液中攝取營養的同時，也向培養液排出自己的代謝產物和其它一些物質，其中有排泄物，也有促細胞生長物質。有人稱之為化學信使，具有促克隆細胞生長作用，實則為生長因子類物質。

單細胞同化營養液能力不如群體細胞強；初代培養細胞、有限細胞系（二倍體細胞）不如無限細胞系、轉化細胞和腫瘤細胞強。轉化細胞和腫瘤細胞強的原因，可能與它們有自泌（ Autocrine）和內泌（Endocrine），即自己合成生長因子能力有關。

材料與儀器

細胞
Hanks 培養液胰蛋白酶
離心機濾膜

步驟

一、適應性培養基

1. 培養同源細胞（未克隆前時的同一細胞）至半匯合狀態時，更換一次培養液，再繼續培養24~48 小時后，吸出所有培養液；

2. 離心

3000~4000 /分，離心10 分鐘后，吸取上清液；

3. 濾過

再經直徑0.22 μm濾孔的濾膜過濾，低溫凍存貯備用；用時取1 分適應培養基+ 2 分培養基混合使用。

二、飼細胞

1. 取原代培養的人或動物胚胎成纖維細胞，90 %匯合時制成細胞懸液，再按105 細胞/毫升重新接種培養；

2. 在細胞半匯合時，準備0.25 μg/ml的絲裂霉素C（MitomycineC），按2 μg/106 細胞的量加入到培養瓶中過夜；或用射線單次照射，劑量30~50 戈瑞（Gy）；

3. 細胞經上述處理后，Hanks液漂洗兩次、更換培養液、再培養24 小時，胰蛋白酶消化細胞制成懸液，按5×104 /ml（104 細胞/cm2）接種入新培養基中；

4. 48 小時后，即可用于細胞克隆之用。

三、底物特殊處理

1. 制備濃度為1 mg/ml的多聚右旋賴氨酸的水溶液，用以濕潤培養瓶底；

2. 倒出多聚賴氨酸液，用5 mlPBS沖洗一次后，可立即使用，或存數周內使用亦可。

四、適應性底物

1. 纖維蛋白原液

纖維蛋白原液 250 mg，NaCl 800 mg，枸櫞酸鈉 25 mg，玻璃三蒸餾水 1000 ml，濾過法滅菌。

2. 向培養皿中先加1 ml纖維蛋白原液，然后再續加4 ml含有凝血酶原的培養液，迅速用吸管頭充分混合，數分鐘后便凝集形成一層清晰的膠狀膜；

3. 再把細胞接種于此膜之上；也可先把細胞加入到含有凝血酶原的培養液中，在加入纖維蛋白原液后，再讓細胞附在膠膜上生長。

注意事項

1. 分離適應性培養基時一定要利用處于指數增生期時的細胞。因此時的細胞生長最旺盛，機能活躍，向周圍環境釋放促生長的物質最多，培養液中營養成分又未被耗盡，是分離制備的最好時刻。剛分離后的適應性培養基中可能含有少量細胞，一定要通過離心和濾過排除干凈，以免形成假克隆。

常見問題

一、提高克隆形成率的措施

細胞經過稀釋后，在低密度狀態下培養時，克隆形成率明顯下降，即克隆形成率與細胞的密度成正比。對無限細胞系來說尚無嚴重影響，它們的克隆形成率一般很少降到10 %以下。但初代培養細胞和有限細胞系的克隆形成率則很低，僅有0.5 %~5 %，甚至為零。因此必須提高細胞克隆形成率才易克隆成功，為此常采取以下一些措施：

1. 培養基
為提高細胞克隆形成率，選擇適當的培養基是非常重要的環節，現知以下一些培養基用作克隆時效果可能較好。