胃上皮細胞培養實驗

原理

胃癌為我國高發癌癥之一，培養正常人胃上皮細胞對研究胃癌癌變機理有很大應用價值。近年來培養人的腎臟上皮、氣管上皮、前列腺上皮等都有報道，但培養人胃上皮細胞少見成功。近年我研究室通過培養90例正常胃上皮細胞初代培養獲得成功，并建成轉化細胞系（Ges-1）。

培養人正常胃上皮細胞獲得成功主要在于摸索到了適于胃上皮細胞生長的條件，它們主要是

1.  膠原酶和透明質酸酶消化法并用消化細胞；

2.  應用膠原底物培養；

3.  制備含有特定成分的培養基。

材料與儀器

細胞
胰島素 轉鐵蛋白 膠原酶
培養基 離心機 濾膜

步驟

一、培養條件的準備
1.  基礎培養基
DME/F12（Sigma 產），加慶大霉素100 U/ml，pH7.4

2.  完全培養基
（1）在基礎培養基中再附加相關促細胞生長因子和其它成分
 

胰島素（Sigma 產） 5 μg/ml

轉鐵蛋白（Sigma 產） 10 μg/ml

新生牛腦提取物  10 μg/ml
 

（2）新生牛腦提取物制法
①取新生牛腦垂體110 g/mlHEPES緩沖液勻漿；

②10000 轉，離心20 分鐘，取上清；

③水中透析2 天，透析袋為#08667B（Fisher 產）；

④10000轉，離心20 分鐘，取上清；

⑤0.22 微米微孔濾膜濾過除菌，-70 ℃貯以備用。

3.  細胞外基質（ECM）

IN型膠原 8 μg/ml

纖粘連蛋白 10 μg/ml

層粘連蛋白 8 μg/ml

多聚賴氨酸 0.001 ％

酵母提取物（Sigma） 5 ％

將以上混合物用彎頭吸管涂于塑料培養皿表面

4.  消化酶

I型膠原酶（Sigma） 0.5 ％（用DME配）

透明質酸酶（Sigma） 0.5 ％（用DME配）

二、培養程序

1.  取材
取胃潰瘍或胃癌手術切除胃標本遠端非病變區粘膜少許；

2.  清洗
用含慶大霉素（400 μg/ml）和二性霉素（2 μg/ml的Hanks）液漂洗后，用鈍器剝離下粘膜，剪成1 mm3大小；

3.  消化
在I型膠原酶和透明質酸酶中，于37 ℃中消化80 分鐘；

4.  離心
收集細胞懸液，800 轉/分，離心后，Hanks液漂洗兩次；

5.  接種
末次離心后加入含有1 %~2 %胎牛血清的完全培養基，接種入不同孔數的培養板中；接種量依不同實驗目的而定。

細胞接種后一般在16 小時內貼壁，細胞呈多角形，成島狀或片狀生長，以后逐漸聯接成片。初代培養可維持2~3 周，第一周末達高峰，最后逐漸衰退剝落。

常見問題

一、討論
胃上皮細胞培養中證明，多加血清并不能提高促細胞生長作用，是因血清中除含有促細胞生長的PDGF因子外，也含有TGF-β1。我們研究證明TGF-β1有抑制上皮細胞生長作用。但因完全培養基中含有較多促上皮生長因子，仍利于上皮細胞生長。上皮細胞生長對ECM有依賴性，其中以N型膠原對胃上皮細胞作用更好。