流式細(xì)胞術(shù)間接免疫熒光標(biāo)記的樣品制備實(shí)驗(yàn)

原理

取一定量的細(xì)胞懸液，先加入特異的第一抗體，待反應(yīng)完全后洗去未結(jié)合抗體，在加入熒光標(biāo)記的第二抗體，生成抗原-抗體復(fù)合物，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)其上標(biāo)記的熒光素被激發(fā)后發(fā)出的熒光。

材料與儀器

實(shí)驗(yàn)樣品
抗體、PBS溶液
移液器 移液吸頭 離心機(jī)

步驟

一、不同來(lái)源樣品的處理

1 . 培養(yǎng)細(xì)胞

（1）培養(yǎng)細(xì)胞用0.25%的胰酶消化。

（2）PBS或生理鹽水洗滌細(xì)胞2次，再用PBS或生理鹽水懸浮細(xì)胞，加入預(yù)冷的無(wú)水乙醇，終濃度為60%——70% ，快速混勻，并用封口膜封口，置4℃下可保存15天左右。

2. 新鮮標(biāo)本

（1）將標(biāo)本切成1——2mm3的小塊。

（2）PBS或生理鹽水清洗后去除上清，加入0.2％膠原酶（或0.15％胰蛋白酶）37℃消化10——30min（根據(jù)實(shí)驗(yàn)及不同組織確定），并不斷振動(dòng)。

（3）300目尼龍篩過(guò)濾，除去組織團(tuán)塊，PBS洗滌2次，300g離心5min，獲得已消化的細(xì)胞。

3. 石蠟包埋標(biāo)本

（1）標(biāo)本在切片機(jī)上切取3——5片50μm厚的組織片。

（2）將切片徹底脫蠟，梯度乙醇（100％、95％、70％）及蒸餾水水化。

（3）0.5％胃蛋白酶（或胰蛋白酶）37℃消化30min，每隔10min振動(dòng)1次。

（4）300目尼龍篩過(guò)濾，獲得的細(xì)胞懸液PBS洗滌2次，300xg離心5min。

注意：脫蠟一定要完全（若加入100％乙醇無(wú)絮狀物飄起即可）；切片厚薄適宜，太薄碎片多，影響FCM分析結(jié)果，太厚易造成脫蠟不凈；注意掌握消化時(shí)間，避免已釋放的細(xì)胞被消化。

二、制備

1. 取1×106個(gè)細(xì)胞/100μl，先加入一抗混勻，置室溫下避光反應(yīng)30min。

2. 用PBS洗滌細(xì)胞2次，離心沉淀?xiàng)壍羯锨逡海x心轉(zhuǎn)數(shù)一般為800——1000rpm，5min）。

3. 用100μl PBS重懸細(xì)胞，再加入FITC或PE標(biāo)記熒光二抗（用量均按說(shuō)明書(shū)要求加入）混勻，室溫下反應(yīng)30min。

4. 用PBS再洗滌細(xì)胞2次，加入500μl PBS重懸成單細(xì)胞懸液，上機(jī)檢測(cè)。

注意事項(xiàng)

1. 以上兩種染色方法的抗體加入量和反應(yīng)時(shí)間，一般根據(jù)試劑使用說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行。若說(shuō)明書(shū)上未說(shuō)明，應(yīng)先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，掌握好劑量與最佳反應(yīng)時(shí)間后，再進(jìn)行流式樣品的制備。

2. 制備好的樣品，若不能及時(shí)上機(jī)檢測(cè)，用1%——4%的多聚甲醛固定，4℃下可保存5天。

常見(jiàn)問(wèn)題

此法由于二抗一般為多克隆抗體，特異性較差，非特異性熒光背景較強(qiáng)，易影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所以標(biāo)本制備時(shí)應(yīng)加入陰性或陽(yáng)性對(duì)照。此外，由于間標(biāo)法步驟較多，增加了細(xì)胞的丟失，不適用測(cè)定細(xì)胞數(shù)較少的標(biāo)本。