染色體提前凝集標本制備實驗
原理
七十年代初，由于發現M期細胞內有某種促進染色體凝集因子，它無種屬特異性，所以在細胞融合和染色體技術的基礎上，建立了制備染色體提前凝集標本的方法。即讓M期細胞與間期（I期）細胞融合，從而誘導I期細胞染色質提前濃縮成染色體。形成的這種染色體稱提前凝集的染色體(PrematurelyCondensedChromosome，PCC)。這項技術已應用于細胞周期分析、正常細胞和腫瘤細胞染色體的微細結構的研究、多種因素作用細胞使染色體損傷及修復效應的研究，預測某種血液病的病程、愈后及復發的臨床實踐等方面。
材料與儀器
HeLa細胞
PEG Hanks液 RPMI-1640培養基 小牛血清 秋水仙素 KCl 檸檬酸鈉溶液 次甲基蘭染液 PBS Carnoy固定液 Giemsa染液
顯微鏡 離心機 水浴箱 熱吹風機 離心管 針頭注射器 試管架 染色槽 載玻片 酒精燈
步驟
1. 收集培養的M期HeLa細胞取一瓶處于對數生長期的HeLa細胞。
2. 向培養基中加入10 μg/ml 的秋水仙素使終濃度為0.04 μg/ml，在37℃二氧化碳培養箱內繼續培養12小時，使大量生長的細胞被阻斷于M期。
3. 每組取一瓶經上述處理的細胞，以平行于細胞生長面方向反復振搖，使培養液不斷沖涮細胞層（或用吸管吹打），M期細胞因變成球形容易脫離瓶壁而懸浮。
4. 將含有M期細胞的培養基移入離心管中，1 000 rpm 離心5分鐘，棄去上清加入5 ml Hanks液，用吸管吹打成細胞懸液。
5. 收集培養的HeLa細胞取一瓶生長良好的HeLa細胞，棄去培養基。
6. 加入少量0.25%的胰蛋白酶消化2~3分鐘，棄去胰酶消化液。
7. 然后加入5 ml Hanks液，用吸管吹打成單個懸浮細胞備用。
8. 50%PEG的制備
（1）稱取0.5 g PEG（MW4 000），倒入離心管中。
（2）在酒精燈上加熱使之融化（約為0.5 ml）。
（3）再加入預熱的Hanks液0.5 ml 混勻，放在37℃水浴中待用。
9. 細胞融合
（1）將上述1、2兩管細胞倒入一個離心管中充分混勻。1 000 rpm 離心5分鐘，去掉上清，再小心地吸盡殘液。
（2）用指彈法彈散細胞，在37℃水浴條件下吸取0.5 ml 50%PEG，逐滴加入離心管內，并不斷地輕輕搖動，整個過程約90秒鐘。然后迅速加入5 ml Hanks液以終止PEG的作用。在37℃水浴甲靜置5分鐘。
（3）1 000 rpm 離心5分鐘。棄去上清，加入2 ml 有血清的RPMI-1640培養基，同時用針頭的注射器垂直加入10 μg/ml 的秋水仙素1滴，輕輕吹打成懸液，37℃水浴中溫育30~60分鐘。
10. 制備PCC標本
（1）細胞溫育后，1 000 rpm 離心5分鐘棄去上清，加入10 ml 0.075 mol/L KCl低滲液輕輕制成懸液。
（2）在37℃處理25分鐘左右；終止時加入1 ml Carnoy固定液進行固定，1 000 rpm 離心8分鐘，去掉上清。
（3）指彈離心管底部使細胞分散，加入10 ml Carnoy固定液固定30分鐘。
（4）1 000 rpm 離心5分鐘，棄去上清留0.2 ml，用吸管輕輕吹打成懸液。
（5）取預冷的載玻片滴一張片，烤干后，Giemsa染色15分鐘左右，水沖洗，干燥后鏡檢。
11. 結果觀察：在低倍鏡下，可以容易地找到M期與I期細胞融合而誘導產生的PCC圖像，由于處于I期不同時相的細胞均能與M期細胞融合而被誘導產生PCC，因此有三種不同形態特點的提前凝集染色體：G1期PCC、S期PCC和G2期PCC。
（1）形態特點分別是：
①G1期PCC為單線染色體，細長，著色淺呈蓬松的線團狀；
②S期PCC由于染色體解旋，DNA以多點進行復制，復制后的部分著色較深，以雙線染色體片段形式存在，故呈粉碎穎粒狀結構；
③G2期PCC因DNA復制完畢，所以可見凝集的雙線染色體，但較M期染色體細長。
