DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳
【原 理】
瓊脂糖凝膠電泳是重組DNA研究中常用的技術(shù)，可用于分離，鑒定和純化DNA片段。不同大小、不同形狀和不同構(gòu)象的DNA分子在相同的電泳條件下（如凝膠濃度、電流、電壓、緩沖液等），有不同的遷移率，所以可通過電泳使其分離。凝膠中的DNA可與熒光染料溴化乙錠（EB）結(jié)合，在紫外燈下可看到熒光條帶，籍此可分析實驗結(jié)果。
【操作步驟】
1、將凝膠成形模具兩端用醫(yī)用膠布封好，水平放置，將選好的梳子放好，梳子底部與模具之間留1mm空間。
2、稱取DNA電泳用瓊脂糖0.8g放入250ml的三角燒杯中，加入100ml 1×TAE緩沖液，混勻后，將燒瓶置于電爐上，加熱煮沸，直至瓊脂糖完全溶解。
3、關(guān)閉電爐，取下三角燒瓶，將其置室溫下冷卻至70℃左右（手握燒瓶可以耐受），再加入溴化乙錠（10mg/ml）5μl，混勻后，即將凝膠溶液倒入膠板鋪板。本實驗所用制膠板約需膠液100ml。
4、室溫下待凝膠完全凝固，需時約30分鐘，揭去二端膠布，拔出梳齒，將膠板放入電泳槽中。
5、在電泳槽中加入1×TAE緩沖液，以高出凝膠表面2mm為宜。
6、取EP管三支，標(biāo)號，如下表所示準(zhǔn)備電泳樣品。
1 | 2 | 3 | |
樣品 | λDNA/HindⅢ | 未酶解質(zhì)粒 | 酶解質(zhì)粒 |
10μl（lr） | 10μl（~2r） | 10μl（~2r） | |
6×點樣液 | 2μl | 2μl | 2μl |
7、將上面三管樣品置震蕩器上混勻，短暫離心。
8、用加樣器吸取樣品。依次分別加入三個點樣孔中，注意加樣器吸頭應(yīng)恰好置于凝膠點樣孔中，不可刺穿凝膠，也要防止將樣品溢出孔外。
9、接通電源，調(diào)節(jié)電壓至50伏，電泳90分鐘后，將凝膠板取出，在紫外燈下觀察結(jié)果。
注：1、細菌噬菌體DNA全長49.01kb，其序列及酶切位點已研究清楚，它經(jīng)不同的限制性內(nèi)切酶消化后可產(chǎn)生不同的電泳帶圖譜。因為每條區(qū)帶的DNA長度是已知的，所以被選為基因工程中常用的DNA分子大小標(biāo)準(zhǔn)，與其進行比較計算，即可得到待測DNA片段的長度，λDNA經(jīng)HindⅢ消化后產(chǎn)生7條區(qū)帶，依次為23.7；9.46；6.75；4.26；2.26；1.98；0.58(kb)。
2、溴化乙錠為一種有毒試劑，使用時一定要戴手套操作，注意防護。
【 儀器 與器材】
1、電泳儀
2、水平式核酸電泳槽
3、紫外燈
【 試劑 與材料】
1、瓊脂糖
2、6×點樣緩沖渡：0.25%溴酚蘭、40%蔗糖
3、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：λDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：λDNA/HindⅢ
4、50×TAE電泳緩沖液貯存液配方：（50×）每升
242g Tris
57.1ml 冰醋酸
100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）
1×緩沖液濃度：0.04mol/L Tris HAc、0.002mol/L EDTA
5、0.8%瓊脂糖：0.8g瓊脂糖用100ml 1×TAE沸 水浴 溶解
6、10mg/ml EB 1.0g 溴乙錠
100ml 三蒸水
【附 注】
影響DAN片段 瓊脂 糖電泳的幾個因素：
1、DNA分子的大小：線性DNA分子的遷移率與其分子 量的對數(shù)值成反比。
2、 瓊脂 糖濃度：一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移率是不相同的。相反，在一定濃度的瓊脂糖凝膠中，不同大小的DNA片段的遷移率也是不同的。若要有效地分離不同大小的DNA，應(yīng)采用適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠。
瓊脂糖凝膠濃度 | 可分辨的線性DNA片段大小（kb） |
0.4 | 5~60 |
0.7 | 0.8~10 |
1.0 | 0.4~6 |
1.5 | 0.2~4 |
1.75 | 0.2~3 |
2.0 | 0.1~3 |
瓊脂糖凝膠濃度 | 可分辨的線性DNA片段大小（kb） |
3、DNA分子的形態(tài)：在同一濃度的瓊脂糖凝膠中，超螺旋DNA分子遷移率比線性DNA分子快，線性DNA分子比開環(huán)DNA分子快。
4、電流強度：每厘米凝膠電壓不超過5V，若電壓過高分辨率會降低，只有在低電壓時，線性DNA分子的電泳遷移率與所用電壓成正比。
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