電泳技術(shù)原理、分類及分析方法
電泳法，是指帶電荷的供試品（蛋白質(zhì)、核苷酸等）在惰性支持介質(zhì)（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等）中，于電場的作用下，向其對(duì)應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動(dòng)，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計(jì)算其百分含量的方法。
電泳技術(shù)的基本原理和分類
在電場中，推動(dòng)帶電質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)的力（F）等于質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷量（Q）與電場強(qiáng)度（E）的乘積。F＝QE質(zhì)點(diǎn)的前移同樣要受到阻力（F）的影響，對(duì)于一個(gè)球形質(zhì)點(diǎn)，服從 Stoke定律，即：F′＝6πrην式中r為質(zhì)點(diǎn)半徑，η為介質(zhì)粘度，ν為質(zhì)點(diǎn)移動(dòng)速度，當(dāng)質(zhì)點(diǎn)在電場中作穩(wěn)定運(yùn)動(dòng)時(shí)：
F＝F′即 QE＝6πrην
可見，球形質(zhì)點(diǎn)的遷移率，首先取決于自身狀態(tài)，即與所帶電量成正比，與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。除了自身狀態(tài)的因素外，電泳體系中其它因素也影響質(zhì)點(diǎn)的電泳遷移率。
電泳法可分為自由電泳（無支持體）及區(qū)帶電泳（有支持體）兩大類。前者包括 Tise-leas式微量電泳、顯微電泳、等電聚焦電泳、等速電泳及密度梯度電泳。區(qū)帶電泳則包括濾紙電泳（常壓及高壓）、薄層電泳（薄膜及薄板）、凝膠電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）等。
自由電泳法的發(fā)展并不迅速，因?yàn)槠潆娪緝x構(gòu)造復(fù)雜、體積龐大，操作要求嚴(yán)格，價(jià)格昂貴等。而區(qū)帶電泳可用各種類型的物質(zhì)作支持體，其應(yīng)用比較廣泛。本節(jié)僅對(duì)常用的幾種區(qū)帶電泳分別加以敘述。
影響電泳遷移率的因素
⒈電場強(qiáng)度 電場強(qiáng)度是指單位長度（cm）的電位降，也稱電勢梯度。如以濾紙作支持物，其兩端浸入到電極液中，電極液與濾紙交界面的紙長為 20cm，測得的電位降為 200V，那么電場強(qiáng)度為200V/20cm＝10V/cm。當(dāng)電壓在500V以下，電場強(qiáng)度在 2-10v/cm 時(shí)為常壓電泳。電壓在 500V 以上，電場強(qiáng)度在20-200V/cm 時(shí)為高壓電泳。電場強(qiáng)度大，帶電質(zhì)點(diǎn)的遷移率加速，因此省時(shí)，但因產(chǎn)生大量熱量，應(yīng)配備冷卻裝置以維持恒溫。
⒉溶液的pH值 溶液的pH決定被分離物質(zhì)的解離程度和質(zhì)點(diǎn)的帶電性質(zhì)及所帶凈電荷量。例如蛋白質(zhì)分子，它是既有酸性基團(tuán)（-COOH），又有堿性基團(tuán)（-NH 2 ）的兩性電解質(zhì)，在某一溶液中所帶正負(fù)電荷相等，即分子的凈電荷等于零，此時(shí)，蛋白質(zhì)在電場中不再移動(dòng)，溶液的這一pH值為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（isoelctric point，pI）。若溶液pH處于等電點(diǎn)酸側(cè)，即pH＜pl，則蛋白質(zhì)帶正電荷，在電場中向負(fù)極移動(dòng)。若溶液pH處于等電點(diǎn)堿側(cè)，即pH＞pl，則蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，向正極移動(dòng)。溶液的pH離pl越遠(yuǎn)，質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷越多，電泳遷移率越大。因此在電泳時(shí)，應(yīng)根據(jù)樣品性質(zhì)，選擇合適的pH值緩沖液。
⒊溶液的離子強(qiáng)度 電泳液中的離子濃度增加時(shí)會(huì)引起質(zhì)點(diǎn)遷移率的降低。其原因是帶電質(zhì)點(diǎn)吸引相反符合的離子聚集其周圍，形成一個(gè)與運(yùn)動(dòng)質(zhì)點(diǎn)符合相反的離子氛（ionic atmosphere），離子氛不僅降低質(zhì)點(diǎn)的帶電量，同時(shí)增加質(zhì)點(diǎn)前移的阻力，甚至使其不能泳動(dòng)。然而離子濃度過低，會(huì)降低緩沖液的總濃度及緩沖容量，不易維持溶液的 pH值，影響質(zhì)點(diǎn)的帶電量，改變泳動(dòng)速度。離子的這種障礙效應(yīng)與其濃度和價(jià)數(shù)相關(guān)?？捎秒x子強(qiáng)度 I表示。
⒋電滲 在電場作用下液體對(duì)于固體支持物的相對(duì)移動(dòng)稱為電滲（electro-osmosis）。其產(chǎn)生的原因是固體支持物多孔，且?guī)в锌山怆x的化學(xué)基團(tuán)，因此常吸附溶液中的正離子或負(fù)離子，使溶液相對(duì)帶負(fù)電或正電。如以濾紙作支持物時(shí)，紙上纖維素吸附OH 帶負(fù)電荷，與紙接觸的水溶液因產(chǎn)生H 3 O + ，帶正電荷移向負(fù)極，若質(zhì)點(diǎn)原來在電場中移向負(fù)極，結(jié)果質(zhì)點(diǎn)的表現(xiàn)速度比其固有速度要快，若質(zhì)點(diǎn)原來移向正極，表現(xiàn)速度比其固有速度要慢，可見應(yīng)盡可能選擇低電滲作用的支持物以減少電滲的影響。
電泳分析常用方法
（一）醋酸纖維素薄膜電泳
醋酸纖維素是提纖維素的羥基乙?；纬傻睦w維素醋酸酯。由該物質(zhì)制成的薄膜稱為醋酸纖維素薄膜。這種薄膜對(duì)蛋白質(zhì)樣品吸附性小，幾乎能完全消除紙電泳中出現(xiàn)的“拖尾”現(xiàn)象，又因?yàn)槟さ挠H水性比較小，它所容納的緩沖液也少，電泳時(shí)電流的大部分由樣品傳導(dǎo)，所以分離速度快，電泳時(shí)間短，樣品用量少，5μg 的蛋白質(zhì)可得到滿意的分離效果。因此特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測。
醋酸纖維素膜經(jīng)過冰醋酸乙醇溶液或其它透明液處理后可使膜透明化有利于對(duì)電泳圖譜的光吸收掃描測定和膜的長期保存。
⒈材料與試劑 醋酸纖維素膜一般使用市售商品，常用的電泳緩沖液為pH8.6 的巴比妥緩沖液，濃度在0.05-0.09mol/L。
⒉操作要點(diǎn)
⑴膜的預(yù)處理：必須于電泳前將膜片浸泡于緩沖液，浸透后，取出膜片并用濾紙吸去多余的緩沖液，不可吸得過干。
⑵加樣：樣品用量依樣品濃度、本身性質(zhì)、染色方法及檢測方法等因素決定。對(duì)血清蛋白質(zhì)的常規(guī)電泳分析，每 cm加樣線不超過1μl，相當(dāng)于60-80μg的蛋白質(zhì)。
⑶電泳：可在室溫下進(jìn)行。電壓為25V/cm，電流為0.4-0.6mA/cm寬。
⑷染色：一般蛋白質(zhì)染色常使用氨基黑和麗春紅，糖蛋白用甲苯胺藍(lán)或過碘酸-Schiff 試劑，脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色。
⑸脫色與透明：對(duì)水溶性染料最普遍應(yīng)用的脫色劑是5％醋酸水溶液。為了長期保存或進(jìn)行光吸收掃描測定，可浸入冰醋酸：無水乙醇＝30:70（V/V）的透明液中。
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