培養細胞的電子顯微鏡觀察實驗

原理

做透射電鏡觀察需進行切片、固定和包埋細胞過程，與一般組織切片法大體相似，其最大的難題是如何把細胞完整無損地從培養瓶皿壁上包埋下來。自從定型產品塑料薄膜問世后，這一困難已被克服。應用無菌塑料薄膜是極其理想的支持物，比用蓋玻片、微孔濾紙、云母和卵殼膜等支持物都好。把細胞直接培養在塑料薄膜上，不僅細胞生長效果好并可與細胞一起包埋切片，免除了很多麻煩。若利用其它材料不僅不利細胞生長，最大缺欠是在包埋前需把細胞從支持物上分離下來，增加了工作量。

材料與儀器

細胞
戊二醛 PBS 醋酸異戊酯
玻璃瓶 離心機 顯微鏡

步驟

一、透射觀察法
透射觀察必須切片，根據培養細胞種類和培養方法不同分原位切片和消化分離切片兩種。

1.  在用玻璃瓶培養細胞做透射觀察時，做原位切片非常復雜。只能采用消化法把細胞制成懸液才能進行包埋和切片。其過程為：消化分離細胞、固定、包埋、切片和觀察幾項。
進行消化時，應注意，消化液的濃度不宜太大、消化時間也要適度，吹打細胞動作要輕微，以防損害細胞表面的微細結構。然后低速離心，令細胞沉于離心管底部（用錐形離心管最好），吸除上清液，立即加戊二醛固定。其余包埋、切片等步驟與一般組織相同，請參閱其它電鏡技術，此不贅述。

2.  單層培養細胞通過消化分離細胞包埋法的優點是獲細胞數量多，便于進行包埋和切片。
缺點一是通過消化可能損傷細胞表面結構，二是消化改變了細胞單層生長時細胞相互接壤關系。
3.  也可采用原位包埋法，為此應把細胞培養在無菌聚苯乙烯塑料薄膜上，便于進行固定、包埋、切片處理。
聚苯乙烯薄膜是一種由聚苯乙烯制成的厚度類似蓋片、無毒、質地柔軟、已消毒包裝的成品（國內尚未見生產）。用時可剪切成適宜的小塊置入瓶中，然后再向瓶中接種細胞，待細胞附于蓋片上并生長后，取出、進行固定、剪切成小塊、直接包埋入Epon膠囊中，很易切片，是原位包埋透射電鏡觀察細胞理想的方法。

如觀察的為懸浮細胞，因懸浮細胞不必做消化處理，可直接進行離心、固定、包埋和切片，細胞保存效果好。

二、掃描觀察
培養細胞掃描觀察非常方便，在觀察貼壁細胞時也需進行消化，制備成細胞懸液后，用Hanks液漂洗1～2 次，除去細胞碎塊和血清蛋白等（以免妨礙觀察）。其余處理與血細胞掃描電鏡觀察法相同。

進行原位掃描觀察培養細胞更為容易，可按以下步驟進行：

1.  加支持物小蓋片培養法培養細胞，至指數增生期；

2.  PBS pH7.4漂洗兩次，以去除培養液；

3.  25 %戊二醛/PBS固定30 分鐘；

4.  PBS漂洗3 次；

5.  1 %OsO4固定45 分鐘；

6.  PBS漂洗3 次；

7.  脫水
丙酮/醋酸異戊酯（1：1）10 分鐘→醋酸異戊酯30 分鐘；

8.  臨界點干燥；

9.  噴金；

10.  掃描電鏡觀察（Hitachs-450）、照像。