活細胞直接觀察實驗

原理

培養(yǎng)的活細胞在一般顯微鏡下觀察時，細胞是透明的，反差很小，難以觀察到細胞清晰結構，只有應用附有相差裝置的顯微鏡，才能使目的物與背底反差增強，能夠看清細胞的輪廓和一些微細結構如線粒體、核仁、染色質(zhì)等。

材料與儀器

細胞
相差聚光器 相差接物鏡

步驟

一、相差裝置的使用

相差裝置或顯微鏡都由兩個主要部分組成：相差聚光器和相差接物鏡。
在每個相差接物鏡的光學系統(tǒng)中都有一個光環(huán)透鏡；在聚光器里有數(shù)個可轉換的相位板，一定倍數(shù)的接物鏡使用時需與相應的相位板一致。相差觀察時對照明要求嚴格，光軸要對正，視野照明光度應均勻。

1.  工作步驟

（1）先調(diào)好相位板，使聚光器相位板號與接物鏡放大倍數(shù)（相位板）相一致；

（2）然后抽出接目鏡，再換輔助望遠鏡，移動輔助鏡筒并調(diào)整聚光器相位板，使視野中兩個大小一樣的光環(huán)（如不同說明倍數(shù)不一致）必須相互吻合；

（3）再重新?lián)Q上原接目鏡，即成相差圖像；當更換不同倍數(shù)接物鏡時，需按上述過程重新調(diào)節(jié)。

二、細胞

培養(yǎng)細胞生長在瓶底上，最適用倒置光相差顯微鏡觀察，而且需附有長焦距集光器，才能觀察厚度較大的培養(yǎng)瓶皿。
培養(yǎng)瓶壁厚度都＞20 μm，只限于用40×接物鏡，若用油浸鏡觀察細胞更微細的結構，需用支持物培養(yǎng)法；把細胞培養(yǎng)在長形蓋片上。
觀察時從瓶中取出制成臨時標本，其方法如下

1.  取一大型載物片，另取小塊優(yōu)質(zhì)濾紙剪成長方窗形，置于載物片上；

2.  用吸管向紙框中滴數(shù)滴培養(yǎng)液，使之充滿框內(nèi)空間和浸濕紙框；

3.  把生長有細胞的蓋片擔在紙框中（令細胞面向上），再覆以大蓋片。

注意事項

一、相差裝置的使用

1.  對培養(yǎng)瓶、皿要求
相差顯微鏡觀察要求底物要平坦、質(zhì)地均勻、透光度好；一般玻璃瓶凹突不平不適做相差觀察和攝影，用質(zhì)地均勻的塑料培養(yǎng)瓶最好。

2.  準備
觀察和攝像前要擦凈培養(yǎng)瓶面，勿使殘留污跡影響透光度。

3.  調(diào)光
調(diào)整照明光的照明度和光軸，令視野照明均勻。對正光軸是顯微攝影的重要條件，忽視時不易獲理想效果。

4.  在無自控攝像裝置初次拍攝時，應把放大倍數(shù)、照明強度和曝光等條件一一記錄下來；做一組不同曝光時間的試驗，顯影后選最佳組合，作為以后再拍攝時的標準。

二、細胞

1.  觀察時液體不斷蒸發(fā)，應隨時從標本側方滴加營養(yǎng)液；但不宜過多以防液體漫過上方大蓋片，影響油浸觀察和攝影。

2.  本法只限短時間觀察細胞之用；在使用加溫載物臺對維持細胞功能更好，但能觀察2 小時左右，觀察時間過長，隨培養(yǎng)液蒸發(fā)、pH改變，細胞形態(tài)和機能狀態(tài)都將發(fā)生改變。