流式鑒定細胞表面抗原
簡介
流式細胞術（Flow Cytometry，FCM）是利用流式細胞儀檢測單個微粒（單細胞懸液、生物顆粒等）的多項特性或對特定群體加以分選的一門技術，具有快速、準確、客觀的特點，主要包括樣品的液流技術、細胞的計數和分選技術，計算機對數據的采集和分析技術等。
原理
特定波長的激光束直接照射到高壓驅動的液流內的細胞，產生的光信號被多個接收器所接收，一個是在激光束直線方向上接收到的前向角散射光信號（FSC），其他是在激光束垂直方向上接收到的光信號，包括側向角散射光信號 （SSC）和熒光信號。
液流中懸浮的直徑從 0.2~150 μm的細胞或顆粒能夠使激光束發生散射，細胞上結合的熒光素被激光激發后能夠發射熒光。
散射光信號和熒光信號被相應的接收器接收，根據接受到的信號的強弱波動從而反映每個細胞的物理學特征。（通俗的講就是激光束照射由鞘流液包裹的細胞，產生兩種光信號，即散射光信號和熒光信號）。
熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激發后產生，發射的熒光波長與激發波長不同；每種熒光染料會產生特定波長的熒光和顏色，通過波長選擇通透性濾片，可將不同波長的散射光和熒光信號區分開，送到不同的光電倍增管。
用途
液流技術、細胞的計數和分選技術等。
材料與儀器
待檢測樣本、流式直標抗體、PBS
流式 stain buffer、EP 管
固定劑（4% 多聚甲醛）
紅細胞裂解液（血液樣本選用）
步驟
一、細胞流式
1、倒掉細胞培養液，用適量 PBS 把細胞洗一遍，將細胞用胰酶或槍吹打下來，1000 rpm離心 15 min，用 1 ml 流式 stain buffer 重懸，放入標好標簽的 EP 管中
2、300 g，4 ℃，離心 5 min,棄上清，用 100 μL stain buffer 重懸細胞。
3、加入適量體積的細胞表面標記物偶聯抗體或同型對照。
4、4 ℃ 避光孵育 30 min 以上（可放置旋轉儀上旋轉以充分孵育）
5、加入 1 ml stain buffer 清洗細胞，300 g，4 ℃，離心 5 min，棄上清（如不需要破膜直接跳至第 10 步）
6、加入 100 μl 固定劑，室溫下避光孵育 15 分鐘。
7、用 1 ml stain buffer 洗滌一次
8、300 g，4 ℃，離心 5 min，棄上清，加入 100 μl 破膜劑和適量體積的胞內抗體或相應同型對照，4 度避光孵育 20min~30min（可放置旋轉儀上旋轉以充分孵育）。
9、加入 1 ml stain buffer 清洗細胞，300 g，4 ℃，離心 5 min，棄上清。
10、用 200 μL stain buffer 重懸細胞，及時上機分析；或用 200 μL 4% 甲醛固定，2~8 °C 避光保存，并在 24 小時內對固定完的細胞進行分析。
二、組織流式
1、取適量新鮮組織于標記好的 EP 管中，加入 1 ml PBS。用剪刀將組織剪成碎塊，用勻漿機將組織勻至單細胞懸液（基本看不到大塊組織）。
2、過濾器除去組織殘渣
3、300 g，4 ℃，離心 5 min，棄上清，用 100 μL stain buffer 重懸細胞。
4、加入適量體積的細胞表面標記物偶聯抗體或同型對照。
5、4 ℃ 避光孵育 20min~30min（可放置旋轉儀上旋轉以充分孵育）
6、加入 1 ml stain buffer 清洗細胞，300 g，4 ℃，離心 5 min，棄上清（如不需要破膜直接跳至第 11 步）。
7、加入 100 μl 固定劑，室溫下避光孵育 15 分鐘。
8、用 1 ml stain buffer 洗滌一次。
9、300 g，4 ℃，離心 5 min，棄上清，加入 100 μl 破膜劑和適量體積的胞內抗體或相應同型對照，4 ℃ 避光孵育 30 min 以上（可放置旋轉儀上旋轉以充分孵育）。
10、加入 1 mL stain buffer 清洗細胞，300 g 4 ℃ 離心 5 min，棄上清。
11、用 200 μLstain buffer 重懸細胞，及時上機分析，或用 200 μL 4% 甲醛固定，2~8 °C 避光保存，并在 24 小時內對固定完的細胞進行分析。
三、全血流式
1、取 100 μl 肝素抗凝的人外周血， 加入適量流式抗體，混勻，4 ℃ 避光孵育 20~30 分鐘。（如需破膜可參考上述破膜步驟）
2、加入 1.5×紅細胞裂解液 2 ml 混勻，室溫避光孵育 10~15 分鐘，至液體澄清透明（若溶液未澄清透明，請重新振蕩混勻，再放置 2 分鐘，至液體澄清透明）。
3、1000 rpm 離心 5 分鐘，棄上清。
4、加入 1 ml stain buffer 混勻， 300 g 4 ℃ 離心 5 min，棄上清。
5、用 200 μL stain buffer 重懸細胞，及時上機分析，或用 200 μL 4% 甲醛固定，2~8 °C 避光
保存，并在 24 小時內對固定完的細胞進行分析。
心臟或脾臟等其他實體組織流式細胞術實驗步驟及圈門示意圖（Circulation. 2020 Mar 31;141(13):1080-1094.）
注意事項
1. 我們這里所介紹的是細胞表面抗原的檢測，細胞內抗體需要進行破膜步驟。不同胞內抗體需搭配使用不同破膜試劑盒，建議使用前咨詢購買抗體的公司需使用何種破膜試劑盒。
2. 流式細胞術一般用于活細胞檢測，通常需要當天完成上機前的所有實驗，如果當天來不及處理，可以用多聚甲醛固定液固定，然后放置 4° 冰箱隔天進行上機檢測。
3. 流式上機前一般需要制備單染管，尤其是進行多重標記，可以進行熒光補償調節。
常見問題
1. 利用流式細胞術進行多抗體標記時，應該如何選擇抗體？
首先需要確定所在實驗室使用的流式細胞儀支持的熒光通道，這是最先需要明確的，其次可以通過調研已發表文獻，參考文獻中使用的多色抗體及門控通道。
