整裝培養細胞生物膜系統的標本制備及觀察實驗
原理
高錳酸鉀固定液能除掉細胞內的蛋白質成份，而保留膜的脂類成分，其結果，細胞骨架和細胞內可溶性蛋白質等被去除，增加了標本的透明度，同時內質網、線粒體、高爾基體、溶酶體等生物膜系統被完整地保存下來。高錳酸鉀固定劑在固定標本的過程中，能形成二氧化錳，可在細胞的各種膜結構的脂類親水端形成微細的沉淀，結果標本不需染色，即能在相差顯微鏡和透射電鏡下清晰地顯示細胞生物膜系統全貌。
材料與儀器
腎上皮細胞
高錳酸鉀 秋水仙素 PBS Formvar液
顯微鏡 相差顯微鏡 透射電子顯微鏡 鎳網 載玻片 蓋玻片 培養皿 CO2培養箱
步驟
一、高錳酸鉀固定法顯示用藥（秋水仙素處理）前后CV-1細胞生物膜系統光鏡標本的制備及觀察。
1. 取無菌蓋玻片，分別放入二個直徑5 cm 的培養皿中，接種CV-1細胞，加3 ml 培養基。
2. 加蓋做好標記，移入CO2培養箱培養24小時。其中一個培養皿在終止培養前4小時，加入10 ug/ml 秋水仙素0.3 ml。
3. 在倒置顯微鏡下觀察選定長有鋪展良好細胞的蓋玻片，終止培養，倒掉培養液。
4. PBS液沖洗蓋玻片二次，清除細胞表面的培養基和雜質。
5. 取出蓋玻片，將長有鋪展良好細胞的蓋玻片，細胞面朝上放在載片上。
6. 滴新配制的高錳酸鉀固定劑于蓋玻片上，固定10分鐘。
7. 蒸餾水輕輕地沖洗標本的細胞面5次，去除殘留固定液。
8. 取下蓋玻片，用濾紙吸干多余水份，滴1滴PBS液于載玻片上，將蓋玻片附有細胞面朝下，裝片。
二、高錳酸鉀固定液顯示用藥（秋水仙素處理）前后CV-1細胞生物膜系統電鏡標本的制備及觀察。
1. 用0.5%Formvar液制做支持膜。
2. 將覆有Formvar膜的鎳網經紫外線燈滅菌后，放入直徑5 cm 的無菌培養皿中，加培養基3ml。
3. 接種CV-1細胞于鋪有支持膜的鎳網上，一組是不經藥物處理的作為對照組，另一組是經10 ug/ml 秋水仙素處理的作為實驗組。
4. 實驗組的培養細胞在終止培養前4小時加入10 ug/ml 秋水仙素0.3 ml，放入CO2培養箱中進行細胞培養。
5. 待細胞鋪展開后，取出鎳網，用乳頭吸管滴1滴高錳酸鉀固定液于鎳網上，固定細胞10分鐘。
6. 經上升梯度乙醇系列脫水：30%→50%→70%→85%→90%→95%→100%，每次脫水3分鐘。
7. 待鎳網晾干后，在透射電子顯微鏡下（75 KV 電壓）進行觀察。
三、結果
1. 在光鏡下和透射電子顯微鏡下，內質網呈網狀鋪展于整個細胞質內。
2. 細胞核周圍的內質網形成較稠密三維結構，遠離細胞核周圍的內質網則呈松散的網狀伸展至細胞邊緣。
3. 在電鏡下可見內質網由細管和扁囊構成。除內質網外，還可看到粗大的呈條索狀的線粒體，也可觀察到高爾基器和溶酶體等膜性結構。
4. CV-1細胞經秋水仙素處理后，其內質網向細胞核周圍聚集，細胞邊緣區域不再觀察到內質網。
5. 秋水仙素破壞微管結構，因此，內質網的分布可能與微管的存在有密切關系。
