同源重組法構(gòu)建質(zhì)粒
什么是質(zhì)粒構(gòu)建？
質(zhì)粒構(gòu)建是分子生物學(xué)研究中常用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，質(zhì)粒是能夠?qū)崿F(xiàn)自主復(fù)制的環(huán)狀DNA分子，質(zhì)粒構(gòu)建即是將特定的基因序列插入到工程質(zhì)粒中，再把質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到細(xì)菌、細(xì)胞或者酵母中，使得質(zhì)粒能夠在其中表達(dá)的過程。
同源重組法構(gòu)建質(zhì)粒的原理是？
將選定的目的外源基因（DNA）進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，用限制性內(nèi)切酶切割載體，再使用同源重組酶將切割后的載體與DNA片段連接后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，最后經(jīng)過篩選和測序鑒定出正確的重組克隆質(zhì)粒，實(shí)現(xiàn)目的基因再宿主細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。
用途是什么？
用于外源蛋白的過表達(dá)。
需要哪些材料和儀器？
目的片段的cDNA、引物、載體、限制性內(nèi)切酶、酶切buffer、LB培養(yǎng)基、含LB培養(yǎng)基的細(xì)菌培養(yǎng)皿、同源重組酶、高保真酶、感受態(tài)細(xì)胞DH5α、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、EP管、離心管、移液槍及槍頭等等。
有哪些步驟？
同源重組法構(gòu)建質(zhì)粒的步驟如下：
①根據(jù)目的片段的酶切位點(diǎn)，選擇相應(yīng)的內(nèi)切酶，通過雙酶切法將環(huán)狀載體質(zhì)粒切割成線性化載體，用瓊脂凝膠法回收酶切產(chǎn)物，回收具體方法按照試劑盒來操作；
②用PCR法擴(kuò)增目的片段的序列，用瓊脂糖凝膠法回收擴(kuò)增產(chǎn)物；
③將線性化的載體與擴(kuò)增的片段按比例進(jìn)行連接，50℃條件下，30min或更長時間（1~2h）。將連接好的重組質(zhì)粒（10μl）轉(zhuǎn)入克隆感受態(tài)細(xì)胞DH5α，輕輕吹打均勻（注意一定不要通過振蕩來混勻），冰上靜置30min，然后42℃水浴熱激90s后立即置于冰上靜置冷卻2~3min；
④加入500μl不添加抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖菌1h，轉(zhuǎn)速250rpm；
⑤將上一步的菌液在5000rpm條件下離心5min，棄去上清300μl。再用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，最好是能夠按照不同的梯度來進(jìn)行涂板操作，防止單克隆菌過密或者過疏，用無菌涂布棒在含有質(zhì)粒抗性的平板上涂勻后，放置于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10~12h；
⑥過夜后，用1μl槍頭挑單克隆菌，放置于5ml的含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)10~12h；
⑦質(zhì)粒小提試劑盒提取菌液中的重組質(zhì)粒后，用限制性內(nèi)切酶消化后，進(jìn)行瓊脂糖電泳做酶切鑒定；
⑧在進(jìn)行第七步的同時，可以吸取部分菌液做菌液PCR，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳通過觀察條帶大小來進(jìn)一步鑒定重組質(zhì)粒是否正確；
⑨將鑒定成功的菌液送到測序公司進(jìn)行雙向測序，待測序結(jié)果比對正確后，表示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，可以進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。
注意！！！
1.構(gòu)建質(zhì)粒的時候，目的基因片段不要大于載體的長度，如果基因片段為載體長度的1/2以上，會加大連接的難度；
2.如果后續(xù)的質(zhì)粒需要做蛋白表達(dá)，那么在最開始選擇載體的酶切位點(diǎn)時就要注意是否會發(fā)生移碼突變，否則后續(xù)蛋白表達(dá)會出錯；
3.同源重組法的引物設(shè)計需要在插入片段正/反向PCR引物5‘端引入線性化載體的末端序列，使得PCR產(chǎn)物5’和3‘最末端分別帶有和線性化載體兩末端一致的序列（15~20bp），同源臂的GC含量盡可能低于60%，酶切序列可以選擇性去增加，如果增加的話能夠便于后續(xù)的酶切鑒定；
4.做感受態(tài)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時，注意重組質(zhì)粒的體積不超過感受態(tài)的1/10，否則可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。
常見問題
1.膠回收的產(chǎn)物低、濃度不足以做連接時，可以增加實(shí)驗(yàn)的起始量，因?yàn)榇蟛糠帜z回收試劑盒的回收率僅為30%~60%，所以載體酶切和擴(kuò)增片段時可以用100μl的跑膠體積；
2.擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物無條帶或者條帶弱時，需要檢查引物的Tm值以及GC比，可以更換引物或者改變PCR的條件，使其達(dá)到最優(yōu)；
3.涂板后沒有菌落或很少菌落時，可能是線性化克隆載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物的使用量不足或者過量，或者比例不佳，也可能是使用單酶切載體后載體自連所導(dǎo)致，建議使用雙酶切法切割載體，防止自連；
4.菌液PCR無條帶，可能是載體連接不成功，引物設(shè)計問題所導(dǎo)致的。
