關于小鼠肝組織中淋巴細胞提取過程

　　關于小鼠肝組織中淋巴細胞提取過程，有不明白的小伙伴可以一起來看看啦。針對實驗過程以及用材，方法等既有相同點也有不同點，小伙伴們各自斟酌。

　　取前處理：眼球靜脈注射conA

　　18小時后肝損傷最嚴重，準備取肝。

　　⑴摘眼球放血

　　⑵先用酒精將小鼠的腹部淋濕，再用剪刀剪開外皮，再用手撕開，拿鑷子把肝取出

　　⑶把肝放入提前準備好的培養皿中，培養皿中有些1x PBS

　　⑷取一張未用過的大小合適的鋼網，把肝放到鋼網上并把鋼網照到培養皿上，按緊，用針管塞研磨肝組織，直至研碎

　　⑸把研磨好的肝組織液轉移到錐形離心管中，并用1x PBS沖洗殘留組織。用1x PBS把所有的錐形離心管液體加到一個高度

　　⑹500轉 離心1分鐘后 取上清并把上清轉入到新的錐形離心管中，轉管時用鋼網過濾

　　⑺2200轉 離心10分鐘后 棄去上清

　　⑻在離心期間配制percoll梯度離心液：

　　90%的梯度離心液共20ml：18毫升percoll原溶液+2毫升10x PBS

　　70%的梯度離心液共18ml：12.6毫升90%percoll溶液+5.4毫升1x PBS

　　40%的梯度離心液共18ml：7.2毫升90%percoll溶液+10.8毫升1x PBS

　　⑼把3毫升40%的梯度離心液，倒入到離心后的細胞中，混勻。取新的離心管，每個錐形離心管中先加入3毫升70%的梯度離心液，在把懸有細胞的40%的梯度離心液加入到盛有70%的梯度離心液的離心管中，注意第一槍要緩慢加入使它形成一個穩定的液面，兩層液體體積比最好為3:3

　　⑽1260 G ,20度,升6,降2,離心30分鐘后形成三個液面，紅細胞會沉入最下層液面，中層有淋巴細胞，上層為厚厚的一層肝組織的其它細胞(應該為肝的實質細胞)

　　⑾越過上層界面吸取中層液體（中間為薄薄的一層白色淋巴細胞，吸取時會把上層40%液體吸入），大約有三毫升，把吸取的液體放到新的錐形離心管中并加入適量1xPBS沖洗，然后2200轉 離心10分鐘

　　⑿離心后棄去上清，向其中加入少許1x PBS（如200微升），吹打混勻，轉入96孔圓底細胞培養板中

　　⒀2000轉 離心5分鐘，棄去上清 注意棄上層液體不要棄第二次，防止液體回流把細胞棄出

　　以下步驟在超凈工作臺中進行，用之前應進行準備工作紫外照射，通風，亮燈，75%的酒精擦拭桌面、微量移液器等。

　　⒁取15毫升RPMI—1640完全培養液（含有10%的胎牛血清即FBS），向其中加入PMA(1:1428)，Ion(1:1000)，Glogistop(1:1000)，IL-2（1:500）；其中PMA和Ion刺激淋巴細胞成倍分泌細胞因子，Glogistop抑制細胞因子向細胞外的分泌，便于后期檢測，其較Glogiplug應用范圍更廣，作用相同，IL-2可刺激淋巴細胞的增殖；使它們混合均勻

　　⒂每孔加入200微升配好的培養液（共培養了12個孔），蓋上蓋子

　　⒃把細胞培養板放入到37度水泵式二氧化碳培養箱中培養

　　⒄6小時后，取出2000轉 離心5分鐘 棄上清

　　染色前準備：每孔應配成50微升的體系，表面染色用1xPBS配，12個孔共需600微升，其中每種抗體加入的比例為1：200即需要抗體，600 x 1/200=3微升，其余用1xPBS補滿即可（也可取600微升1xPBS再加入3微升抗體，因比例較小可這樣粗略計算）。胞內染色：表面染色結束后用200毫升1xPBS洗一遍，2000轉 離心5分鐘 棄上清；之后先用2%的甲醛（2g甲醛溶于100ml 1xPBS中，也可用37%-45%的甲醛溶液稀釋得到）固定 避光30分鐘，再進行打孔，用0.5%的saponin（0.5g  saponin溶于100ml 1xPBS中）打孔 避光30分鐘；用INF-?抗體(也配成50微升的體系此次用saponin配)染色30分鐘 避光

　　⒅細胞表面染色，此次用抗體NK1.1和抗體TCRβ（也可用抗體CD3）染色,4℃ 15分鐘 避光；染好后加200微升1xPBS洗去未染上的抗體，2000轉 離心5分鐘 棄上清

　　⒆用2%的甲醛固定細胞 避光 30分鐘，用0.5%的saponin打孔 ，避光30分鐘；用量：在細胞培養板中固定、打孔各用200微升，若在流式管中固定、打孔各用2ml；用INF-?抗體染色30分鐘 避光，染好后用200微升1xPBS沖洗，2000轉 離心5分鐘 棄上清；向孔中加入適量1xPBS吹打混勻，轉入流式上機檢測的管中，轉好后加入適量1xPBS待測。