微生物分離純化實(shí)驗(yàn)-簡易單孢子分離法
原理
簡易單孢子分離法是一種不需顯微單孢操作器，直接在普通顯微鏡下利用低倍鏡分離單孢子的方法。它采用很細(xì)的毛細(xì)管吸取較稀的萌發(fā)的孢子懸浮液滴在培養(yǎng)皿蓋的內(nèi)壁上，在低倍鏡下逐個(gè)檢查微滴。將只含有一個(gè)萌發(fā)孢子的微滴放一小塊營養(yǎng)瓊脂片，使其發(fā)育成微菌落。再將微菌落轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中，即可獲得僅由單個(gè)孢子發(fā)育而成的純培養(yǎng)。
材料與儀器
米曲霉
無菌水 4% 水瓊脂
查氏瓊脂培養(yǎng)基 無菌三角瓶 玻璃珠 玻璃管 鑷子 無菌漏斗 棉花 接種環(huán) 無菌培養(yǎng)皿 無菌小刀 顯微鏡 記號(hào)筆
步驟
1. 厚壁磨口毛細(xì)滴管的制備
截取一段玻璃管，在火焰上燒紅所要拉細(xì)的區(qū)域，然后用鑷子夾住其尖端，在火焰上拉成很細(xì)的毛細(xì)管。從尖端適當(dāng)?shù)牟课桓顢啵蒙拜喕蛏凹堊屑?xì)濕磨。使管口平整，光滑。
2. 分離小室的準(zhǔn)備
取無菌培養(yǎng)皿（D9 cm）倒入約 10 ml 4% 水瓊脂作保濕劑。在皿蓋上用記號(hào)筆（最好用紅色）如圖所示畫方格。待凝后倒置于 37℃ 恒溫箱烘數(shù)小時(shí)。使皿蓋干燥。
3. 萌發(fā)孢子懸液的制備
3.1 孢子懸液的制備
用接種環(huán)挑取米曲霉孢子數(shù)環(huán)接入盛有 10 ml 查氏培養(yǎng)液及玻璃珠的無菌三角瓶中，振蕩 5~10 min。使孢子充分散開。
3.2 過濾
用無菌漏斗（塞棉花）或自制的過濾裝置將上述充分散開的孢子液過濾，收集過濾液。
3.3 孢子萌發(fā)
將孢子過濾液用血球計(jì)數(shù)板測定孢子的濃度，再用查氏培養(yǎng)液調(diào)整孢子液至 0.5~1.5 × 106 個(gè)孢子 1 毫升后置 28℃ 培養(yǎng) 8 h。
3.4 點(diǎn)樣
用無菌自制的厚壁磨口毛細(xì)滴管吸取萌發(fā)孢子液少許，快速輕巧地點(diǎn)在培養(yǎng)皿的內(nèi)壁的方格內(nèi)中，每微滴面積略小于顯微鏡低倍鏡視野。依次將每方格點(diǎn)上萌發(fā)孢子液，成為分離小室最后將皿蓋小心快速翻過來，蓋在原來的平板上。
3.5 鏡檢
按圖 VII-7 所示，將點(diǎn)樣的分離小室平板放在顯微鏡鏡臺(tái)上，用低倍鏡逐個(gè)檢查皿蓋內(nèi)壁上的微滴．如果觀察到某微滴內(nèi)只有一個(gè)萌發(fā)孢子時(shí)用記號(hào)筆在皿蓋上作上記號(hào)。
3.6 加薄片培養(yǎng)基
取少量查氏瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿（培養(yǎng)限先置 45℃ 預(yù)熱）中制成薄層平板。待其凝固后用無菌小刀片將平板瓊脂切成若干小片（其面積應(yīng)小于培養(yǎng)皿蓋上所畫小方格的面積），然后挑一小片放在作有記號(hào)的單孢子微滴上，其他依次進(jìn)行，最后蓋好皿蓋。
3.7 培養(yǎng)
將分離小室平板置 28℃ 培養(yǎng) 24 h，直至單孢子形成微菌落。
3.8 轉(zhuǎn)種
用無菌微型小刀小心地挑取長有微菌落的瓊脂薄片移至新鮮的查氏培養(yǎng)基斜面或液體培養(yǎng)中，置 28℃ 培養(yǎng) 4～7d。即可獲得由單孢子發(fā)育面成的純培養(yǎng)。
注意事項(xiàng)
毛細(xì)滴管要求達(dá)到點(diǎn)樣時(shí)出液均勻、快速，每微升孢子懸液約點(diǎn) 50 微滴。每滴的大小略小于低倍鏡的視野。
