抗生素效價生物測定實驗-管碟法
原理
管碟法是擴散法中的一種，是將已知濃度的標準抗生素溶液與未知濃度的樣品溶液分別加到一種標準的不銹鋼小管（即牛津小杯）中，在含有敏感試驗菌的瓊脂表面進行擴散滲透。比較兩者對被試菌的抑制作用，測量出抑菌圈的大小，以計算抗生素的濃度。在一定的濃度范圍內，抗生素的濃度與抑菌圈直徑在雙周半對數表上（濃度為對數值，抑菌圈直徑為數字值）成直線函數關系，從樣品的抑菌圈直徑可在標準曲線上求得其效價。
材料與儀器
金黃色葡萄球菌 產黃青霉
0.85% 無菌生理鹽水 50% 無菌葡萄糖 青霉素鈉鹽標準品
培養基 I（牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基） 培養基 II（培養基 I 加 0.5% 葡萄糖） 培養板 牛津杯／標準不銹鋼小管 陶瓦圓蓋
步驟
1. 0.2 mol/L 的 pH6.0 磷酸緩沖液的配制
準確稱取 KH2PO4 0.8 g 和 K2HPO4 0.2 g，置 100 ml 容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，滅菌備用。
2. 標準青霉素溶液的配制
精確稱取 15-20 mg 氨芐青霉素標準品，每毫克含 1667 單位（1 667 U/mg, 1 U 即 1 國際單位，等于 0.6 μg），溶解在適量的 0.2 mol/L 的 pH 6.0 磷酸緩沖液中，然后稀釋成 10 U/ml 的青霉素標準溶液，按表 IX-2 配制成不同濃度的青霉素溶液，保存于 5℃ 備用。
3. 青霉素發酵液樣品溶液的制備
用 0.2 mol/L 的 pH 6.0 磷酸緩沖液將青霉素發酵液適當稀釋，備用。
4. 金黃色葡萄球菌菌液的制備
取用培養基 I 斜面保存的金黃色葡萄球菌菌種，將其接種于培養基 II 斜面試管上，于 37℃ 培養 18~20 h，連續傳種 3~4 次，用 0.85% 的生理鹽水洗下，離心后，菌體用生理鹽水洗滌 1~2 次，再將其稀釋至一定濃度（約 109 / ml, 或用光電比色計測定，在波長 650 nm 處；透光率為 20% 左右即可）。
5. 抗生素擴散平板的制備
取滅菌過的平皿 18 個。分別加入已融化的培養基 I 20 ml，搖勻，水平位置使其凝固，作為底層。另取培養基 II 融化后冷卻至 48~50 ℃，加入適量上述金黃色葡萄球菌菌液，迅速搖勻，在每個平板內分別加入此含菌培養基 5 ml，使其在底層上均勻分布，置水平位置凝固后，在每個雙層平板中以等距離均勻放置牛津杯 6 個，用陶瓦圓蓋覆蓋備用。
6. 標準曲線的制備
取上述制備的擴散平板 18 個，在每個平板上的 6 個牛津杯間隔的 3 個中各加入 1 U/ml 的標準品溶液，將每 3 個平板組成一組，共分 6 組。
在第一組的每個平板的3個空牛津杯中均加入 0.4 U/ml 的標準液，如此依次將 6 種不同濃度的標準液分別加入 6 組平板中（如圖 IX-6），每一稀釋度應更換一只吸管，每只牛津杯中的加入置為 0.2 ml 或用帶滴頭的滴管加樣品，加樣量與杯口水平為準，全部蓋上陶瓦蓋后 37 ℃ 培養 16~18 h。
精確測量各抑菌圈的直徑，分別求得每組 3 個平板中 1 U/ml 標準品抑菌圈直徑與其他各濃度標準品抑菌圈直徑的平均值，再求出 6 組中 10 U/ml 標準品抑菌圈直徑的平均值，總平均值與每組 10 U/ml 標準品抑菌圈直徑平均值的差，即為各組的校正值。
例如，如果 6 組 1 U/ml 標準品抑菌圈直徑總平均值為 22.6 mm，而 0.4 U/ml 的一組中 9 個 1 U/ml 標準品抑菌圈直徑平均為 22.4 mm，則其校正數應為 22.6-22.4=0.2，如果 9 個 0.4 U/ml 標準品抑菌圈直徑平均為 18.6 mm 則校正后應為 18.6+0.2=18.8 mm。以濃度為縱坐標，以校正后的抑菌圈直徑為橫坐標，在雙周半對數圖紙上繪制標準曲線。
7.青霉素發酵液效價測定
取擴散平板 3 個，在每個平板上的 6 個牛津杯間隔的 3 個中各加入 1 U/ml 的標準品溶液，其他 3 杯中各加入適當稀釋的樣品發酵液，蓋上陶瓦蓋后培養 16~18 h。
精確測量每個抑菌圈的直徑，分別求出標準品溶液和樣品溶液所致的 9 個抑菌圈直徑的平均值，按照上述標準曲線的制備方法求得校正數后，將樣品溶液的抑菌圈直徑的平均值校正，再從標準曲線中査出標準品溶液的效價，并換算成每毫升樣品所含的單位數。
注意事項
注意控制金黃色葡萄球菌菌液的濃度，以免其影響抑菌圈的大小。一般情況下， 100 ml 培養基 II 中加 3~4 ml 菌液（109/ ml）較好。
