腫瘤細胞的軟瓊脂集落培養實驗

原理

在體外培養基中由一個祖先細胞增殖形成的細胞團，稱之為集落。腫瘤細胞能無限繁殖，所以具有這種能力，而成熟分化的細胞則不能形成集落。

HL-60細胞是一種急性早幼粒細胞白血病細胞，在體外無需加刺激因子，可在軟瓊脂培養基中形成集落。二甲基亞砜是一種細胞分化誘導劑，經二甲基亞砜處理后的HL-60細胞按粒系途徑定向成熟分化，同時細胞的增殖力降低，幾乎全部細胞喪失了軟瓊脂中形成集落的能力。

材料與儀器

HL-60細胞
小牛血清 RPMI1640培養液 臺盼蘭 瓊脂 二甲基亞砜
超凈工作臺 二氧化碳培養箱 顯微鏡 培養瓶 吸管 酒精燈 血細胞計數板 多孔培養板

步驟

1.  收集對數生長期的HL-60細胞，先按實驗十三測定細胞活力，然后調整細胞濃度，制成300~1 000活細胞/ml 的細胞懸液。

2.  取二個培養瓶每個瓶中加9 ml 調整好濃度的細胞懸液，然后各加入1 ml 3%瓊脂（已融化，在65℃水浴中放置），迅速加入，混勻。

3.  用微量加樣器吸140 ul 二甲基亞砜（MDSO），加到一個瓶中，充分混勻，為實驗組，另一瓶不加DMSO，為空白對照組。

4.  取一個16 mm 多孔培養板，每孔加1 ml（35 mm 培養皿需加2 ml）細胞瓊脂懸液，勿有氣泡，將實驗組和對照組分兩組加好，蓋上蓋并作好標記。

5.  在室溫放置20分鐘使細胞瓊脂懸液凝固。

6.  然后移培養板或平皿于CO2培養箱中37℃進行培養。

7.  培養7~10天，肉眼觀察并計數細胞集落。

8.  結果：以肉眼可見的細胞團（含500個以上細胞）作為計數集落的標準。對照組HL-60細胞在含0.3%的軟瓊脂培養基中生長良好，每個孔中可見有多個集落形成，而實驗組HL-60細胞因經二甲基亞砜誘導分化，細胞在軟瓊脂中的集落形成明顯減少。

9.  集落的計數和計算：

（1）集落數=n孔中細胞集落數總和/n孔

（2）集落形成率=集落數/接種培養細胞總數x100%

注意事項

1.玻璃吸管和玻璃培養瓶的消毒：1）高壓蒸汽滅菌15分鐘以上，2）干烤消毒140度2小時以上。

2.消化液（pH7.8）或其它加入液，應用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌，分裝成支置-20度保存。

3.無菌工作臺先清洗后用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射40分鐘以上;各種培養板照射3小時以上。

4.培養基（pH7.2）和血清配制好后要做無菌試驗：將血清按10%加入培養基內，用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取完全培養基5-10ml置培養箱內培養2-3天，肉眼見無渾濁或沉淀等異物。分裝后置4度保存。

5.培養箱應先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍（如有紫外線的應照射1小時以上，如有高溫滅菌的應按程序來菌），至少每月一次。

6.進入操作時應注意先清洗雙手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作時注意無菌臺內空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往，如果數量較多，腫瘤細胞培養瓶應放在與酒精燈平行地方便于操作，瓶與瓶之間應相隔一定的距離，開瓶（蓋）時應先用75%酒精反復擦拭或用燈燒，打開后應用燈先燒口，然后燒蓋。