姊妹染色單體互換標(biāo)本制備與分析實(shí)驗(yàn)
原理
5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromodeoxyuridinc簡(jiǎn)稱BrdU）是胸腺嘧啶核苷的類(lèi)似物。人體淋巴細(xì)胞在含有BrdU的培養(yǎng)液中進(jìn)行DNA復(fù)制時(shí)，BrdU可專(zhuān)一替代胸腺嘧啶核苷，而摻入到新復(fù)制的DNA核苷酸鏈中。因此只要通過(guò)兩個(gè)復(fù)制周期，就可使姊妹染色單體中一條單體的DNA鏈中，有一股鏈?zhǔn)菗饺隑rdU的，而另一條單體的DNA雙鏈，兩股鏈全摻入BrdU。由于雙股都含有BrdU的DNA分子構(gòu)形有變化，使這條染色單體對(duì)某些染色劑的親合力降低，用Giemsa染液染色時(shí)就可清楚看到雙股都含BrdU的DNA鏈所組成的單體著色淺，而另一條單體著色深。這樣就可利用這一技術(shù)檢查同一染色體的兩條姊妹染色單體互換（SCE）的情況。現(xiàn)已證明，許多致突變劑和致癌物質(zhì)可誘發(fā)姊妹染色單體互換和誘發(fā)染色體斷裂、重排。對(duì)這些因素SCE要比染色體畸變敏感的多。因而檢測(cè)姊妹染色單體交換頻率是檢查致癌和致突變劑的細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的一種新方法，它具有靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)。
材料與儀器
人外周血
BrdU溶液 SSC Giemsa染液 PBS
紫外燈 恒溫水浴箱 培養(yǎng)皿 擦鏡紙
步驟
1. 培養(yǎng)液的制備、采血、培養(yǎng)等操作同常規(guī)染色體的制備。（見(jiàn)常規(guī)染色體標(biāo)本制備方法）
2. 在外周血培養(yǎng)24小時(shí)加入BrdU溶液0.2毫升，使終濃度為每毫升培養(yǎng)液含8微克。加入BrdU后，用黑紙包褒培養(yǎng)瓶，置37℃溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
3. 秋水仙素處理方法同前（見(jiàn)染色體標(biāo)本的制備）。
4. 按常規(guī)方法收集細(xì)胞、固定、低滲、制片，并將標(biāo)本片置37℃溫箱中烘片24小時(shí)。
5. 將標(biāo)本面朝上平放于染色槽中，然后加入2xSSC溶液，以溶液不超過(guò)標(biāo)本表面為度。然后在標(biāo)本上復(fù)蓋一張比標(biāo)本稍大的擦鏡紙，使紙邊垂到2xSSC溶液中，用以保持標(biāo)本濕潤(rùn)。
6. 將染色槽置55℃恒溫水浴箱中溫育，上用30 W 紫外燈垂直照標(biāo)本30分鐘，燈距標(biāo)本距離約為10 cm。照射后輕輕取掉擦鏡紙，立即用蒸餾水沖洗標(biāo)本。（水溫為40℃左右）。
7. 用Giemsa染液（原液用pH6.8磷酸緩沖液1：10配制），染色5~10分鐘左右，用自來(lái)水沖洗，空氣干燥后鏡檢。
8. 姊妹染色單體互換的鏡檢分析及頻率計(jì)算
（1）在正常或異常情況下，姊妹染色單體互換的頻率不同。根據(jù)上述標(biāo)本染色單體的明顯色差不同，通過(guò)計(jì)數(shù)可較準(zhǔn)確檢測(cè)姊妹染色單體之間的互換頻率。
（2）選取染色體分散良好，兩條姊妹染色單體染成一深一淺的中期相，凡發(fā)生有姊妹染色單體互換的染色體，可見(jiàn)在深染的染色單體上出現(xiàn)淺染的片段。對(duì)在染色體端部出現(xiàn)的互換計(jì)為一次（一個(gè)SCE）；對(duì)在染色單體中間出現(xiàn)的互換計(jì)為兩次（2個(gè)SCE）；對(duì)在著絲粒部位的，經(jīng)判明不是兩條染色單體發(fā)生扭轉(zhuǎn)者，計(jì)為一次（1個(gè)SCE）。
（3）計(jì)數(shù)30個(gè)中期分裂相的SCE后，計(jì)算SCE的頻率。
①SCE頻率=n個(gè)中期相SCE之和/n個(gè)細(xì)胞
②中國(guó)人正常SCE頻率為5.7 ± 0.4。
