DNA測序的基本原理及準備樣品時的注意事項
一、測序的基本原理：
測序的基本原理是Sanger末端終止法，在酶的作用下將原本是一條長達數百堿基的片斷擴增成數百條片斷，彼此間相差一個堿基。用電泳分離這些片斷后，再通過測序儀將這些信號轉變成峰圖，從而最終形成客戶所看到的測序序列和測序的峰圖。
目前通用的擴增方式是通過PCR的方式進行的起源；其原理簡述如下：PCR類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：
①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；
②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；
③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。
采用PCR的方式擴增目標片斷具有以下優點：
1. 微量的樣品也可進行測序反應
2. 操作簡便
3. 縮短了測序樣品的準備時間。
因此目前所有提供測序服務的公司都是采用PCR擴增目標片斷來進行測序的。當然由于測序反應要求較普通PCR遠為嚴格，因此在所用的酶和反應體系方面均進行了特殊處理。
二、測序的樣品要求：
測序由于是要進行特殊的PCR反應的，因此對樣品的要求與其他試驗的要求有所不同分別簡述之：
1. 樣品的純度：PCR具有短時間內高效的擴增能力，因此樣品的純度對反應有至關重要的影響。當樣品不純的時候，那些雜質會對實驗結果產生干擾。這在PCR產物測序中表現的尤為明顯，在測序結果上表現為峰圖雜亂，過多的不可識別的堿基。
2. 樣品的量：盡管測序反應可以高效的擴增待測得模板，使得測序所需要的模板量大大降低，但是當最低限度的模板量也不能提供的話，會引起測序反應的異常，表現為無反應，峰圖弱，或者反應中斷等。
3. 樣品的形式：這里專指純化的PCR產物和質粒樣品。正常情況下，溶解樣品時常用的溶液有以下幾種形式：水，Tris 溶液，TE（Tris—EDTA）三種。當采用TE為溶劑的時候由于溶液中的EDTA可以干擾測序反應的進行，因此實驗人員在進行測序時需要注意樣品的溶解方式。
三、不同樣品的要求及簡介：
1. 樣品的形式：從測序角度來講最好是由實驗者提供菌液的形式，由公司來提取質粒，這樣可以保證DNA樣品的數量和質量。如果實驗者提供的是質粒或者是純化后的PCR產物，則需要說明其濃度和溶解的方式（原因如上）
2. 不同樣品的說明：
（1）PCR產物：若是PCR產物進行測序時，需要實驗者同時提供PCR的雙向引物各10ul（濃度>5uM/ul），這是因為PCR的引物要求與測序的引物有所不同，因此不能保證一條PCR引物就能夠測成功。雙向引物可以在一條引物無法測序的情況下，改用另一端的引物測序。這樣一來，最好實驗者告知公司一下反應的條件，以便測序公司可以及時調整測序反應。（已純化）濃度 > 50ng/μl、體積> 10 μl；（未純化）濃度 > 100ng/μl、體積> 30 μl；引物要求：濃度>5uM、體積>10 μl
（2）質粒產物：需要提供明確的質粒名稱，大小、濃度以及測序所用的引物名稱，如果是自帶引物測序（條件同PCR測序），最好也能夠標明反應的條件。質粒的大小對于測序也有著一定的影響。樣品中，質粒的總量不低于5ug。
（3）菌液：需要明確的標明所用的抗生素類型和培養條件，以便樣品能夠培養和擴增。
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