發色底物測定大曲中α一葡萄糖苷酶活力
一、實驗目的
通過用發色底物測定α-葡萄糖苷酶活力實驗，了解并掌握外切糖苷酶活力測定方法，使對酶活力的概念有更深入的理解。
二、實驗原理
酶活力是酶蛋白質催化能力的一種定量表示，其活力單位目前大多都采用國際標準單位，亦即每分鐘催化形成一微摩爾產物或消耗一微摩爾底物所需的酶量為一個國際標準單位，通常用”U”表示。蛋白酶與無機催化劑不同，它的催化活力不僅與其自身有關，而且受反應環境的影響，例如，產物抑制作用、反應過程中的酶失活以及抑制因子的生成等，所以酶活力必須用初速度表示。但實際測定時考慮到產物濃度在一定時間內與反應時間呈線性關系，一般就用產物在這段時間內的變化量計算酶活力。
淀粉酶是糖苷水解酶中的一類，它的活力一般都用測定還原糖的辦法進行分析。但由于淀粉酶的四種組分(淀粉-1，4-糊精酶、淀粉-l，4-麥芽糖酶、淀粉-1，6-糊精酶和α-葡萄糖苷酶)的水解產物都是還原糖，因此用還原糖法無法準確測定單一酶活力。而發色底物法則可以克服這種困難，因為它是在糖苷配基上聯上一個發色基團。比如，α-葡萄糖苷酶活力測定是采用對-硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)作反應底物；該底物是無色的。經α-葡萄糖苷酶水解α-1，4-葡萄糖苷鍵后可以釋放出對—硝基苯酚(pNP)，在堿性條件下是黃色的，因此可以通過測定410nm處的吸光度增加值計算酶活力。
三、 儀器 和試劑
實驗原料：
大曲浸提液
儀器
分光光度計、恒溫水浴鍋、移液管(2mL)、試管、吸耳球等。
試劑
1. 對—硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(pNPG)：1.25mM pNPG(75.2mg pNPG溶于200mL 50mM
醋酸緩沖溶液(pH5.6))。
2. 對一硝基苯酚(pNP)：4m mol/LpNP(111.3mg溶于200mL 50mM醋酸緩沖溶液(pH5.6))。
3. 50mM醋酸緩沖溶液(pH5.6)：16.4克NaAC加 12mL HAc并定容至 1000mL。
4. 1M碳酸鈉
四、操作步驟
(一)制作對—硝基苯酚(pNP)標準曲線
按下表分別取不同體積的對—硝基苯酚(4mM)，用50mM醋酸緩沖溶液(pH5.6)稀釋成一系列濃度。然后在分光光度計上測定λ=410nm處的光密度，以濃度為橫坐標，光密度為縱坐標作曲線。
(二)α-葡萄糖苷酶活力測定
取 0.8mL對—硝基苯酚α-D-葡萄糖苷(pNPG)(1.25mM)，加入 0.2mL大曲浸提液，迅速混勻后于40℃ 水浴 中保溫10分鐘，取出并立即加入2mL 1 M的碳酸鈉溶液終止反應，用 分光光度計 測定λ=410nm處的光密度，在標準曲線上查出相當于對—硝基苯酚的量，并計算酶活力。酶活力單位定義為：在上述分析條件下每分鐘催化形成一個微摩爾pNP所需要的酶量為一個活力單位。
五、計算
V—酶液量mL；
n:—酶液稀釋倍數；
t—反應時間(min)
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