FISH技術在白血病中的應用
熒光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization, 簡稱FISH)由于其直觀, 快速, 敏感性高和方便靈活越來越得到廣泛應用, 尤其是在血液學領域中. 因為白血病標本比較容易取得和制備, 不同類型的白血病又往往有其特異的染色體異常, FISH在白血病診斷, 治療監測, 預后估計和微小殘留病檢測等諸方面都正成為不可缺少的重要手段.
FIHS技術本身也在新的需求下不斷更新和完善.FISH的基本原理很簡單, 就是標記了熒光的單鏈DNA(探針)和與其互補的DNA(玻片上的標本)退火雜交, 通過觀察熒光信號在染色體上的位置來反映相應基因的情況.
FISH探針按標記方法可分為直接標記和間接標記: 用 生物 素(biotin)或地高辛(digoxingenin)標記稱為間接標記, 雜交后需要通過免疫熒光抗體檢測方能看到熒光信號, 因而 步驟較多, 操作麻煩, 其優點是在信號較弱或較小時可經抗原抗體反應擴大; 直接用熒光素標記DNA的方法稱為直接標記. 由于直接標記的探針雜交后可馬上觀察到熒光信號, 省去了煩瑣的免疫熒光反應, 不再需要購買熒光抗 體, 也由于近年來熒光互的亮度和抗淬滅性的不斷改進和提高, 直接標記的熒光探針越來越成為首選, 如Vysis公司 的FISH探針均采用直接熒光標記, 并采用多種不同顏色的熒光, 方便在同一標本上同時檢測多鐘異常. 其熒光強度 和信號大小都易于在普通熒光顯微鏡下觀察, 操作過程中也不需要嚴格避光, 使FISH過程變得簡便而易于操作. FISH并不能取代傳統的白血病MCI診斷, 但它卻能使MIC分型更為準確和深入. 我們知道, MIC即細胞形態 學(M), 免疫學(I)和細胞遺傳學(C), 三者結合對白血病進行分型診斷, 對不同類型的白血病采用不同治療方案手段. 隨著人們對白血病的不斷認識, 僅進行MIC分型已不夠全面, 還要加上對白血病的分子(M)診斷, 成為MICM分型. FISH就是連接細胞遺傳學和分子 生物 學的橋梁.
白血病檢測中常用的FISH探針有單一序列探針, 著絲粒探針, 整條染色體探針, 常用方法有單標記FISH, 雙 標記FISH, 比較基因組雜交(CGH), M-FISH 和Rx-FISH等. 各種FISH探針及方法均在白血病的診斷, 治療監測, 預后估計和微小殘留病檢測中起重要作用:
1. 白血病診斷.
白血病的細胞遺傳學研究已經發現了許多白血病特異的染色體易位, 為疾病的診斷和特異治療提供了依據. 目前, 大部分易位累及的白血病相關基因已經被克隆, 可通過檢測些融合基因對白血病進行分子診斷. 常見的單一序列探 針有PML-RAR?[t(15;17), 見于M3, AML1-ETO[t(8;21), 見于M2b], BCR-ABL[t(9;22), 見于CML和ALL], TEL- AML1[t(12;21), 見于兒童前B-ALL]等等, 為方便起見, 商品化的探針多為標記的, 即兩個基因分別用兩種顏色標記, 同時在一張玻片標本上雜交. 用FISH進行融合基因檢測比常規的染色體核型分析要準確, 其敏感性雖略低于RT- PCR方法, 但其假陽性和假陰性率卻大大低于PCR法. 若核型分析, RT-PCR, FISH三者結合則可大大提高白血病診 斷的準確性.
常規細胞遺傳學分析常有一些染色體易位不易發現或有不明來源的標志染色體或有復雜的染色體易位不易診 斷. FISH則可解決這些難題. 白血病的染色體異常分為染色體數目異常和結構異常. 對數目異常, 可采用染色體著 絲粒探針或整條染色體探針[又稱為染色體涂色(Chromosome painting, CP)探針]. 如慢性粒細胞性白血病急變時常常 出現8號染色體三體. 此時8號著絲粒探針或CP探針就很容易診斷了. 目前, 幾乎所有染色體均已有了商品化的著 絲粒和CP探針. CP探針也適用于標志染色體和不易發現或復雜的染色體易位的檢測, t(12;21)的發現就是最好的例子. 染色體涂色往往要在核型分析的基礎上, 選擇可能發生異常染色體探針做雜交, 如果三條以上染色體發生復雜的交互 易位, 需要多次雜交分析才能確定.
為解決這一問題, 在染色體涂色的基礎上開發了M-FISH技術. M-FISH相當于在 一次雜交中給每一條染色體都涂上了不同的顏色, 因而很容易就可看到多條染色體間的復雜易位情況和確定標志染 色體的來源. M-FISH因其這一優點正成為分子遺傳學家手中重要工具, 然而, 對同一條染色體中的易位或倒位它就 無能為力了, 而且, 它也不能精確地顯示染色體斷裂的區帶. 能否讓每條區帶也雜交上不同的顏色呢? 這一想法導 致了彩色核型分析(Rx-FISH)的誕生. 它幾乎解決了上述所有的問題, 然而Rx-FISH探針價格不菲, 目前已有多家公 司正在開發和改進中. 不論是哪一種FISH, 其成功與否都與染色體標本的質量密切相關, M-FISH和Rx-FISH的要求 尤其較高.
除了M-FISH和Rx-FISH外, 在血液病研究中使用較多的一種FISH相關技術是比較基因組雜交(Comparative Genomic Hybridization, CGH). CGH與上述的各種方法有所不同, 它不需要制備患者的染色體標本, 只需抽提腫瘤 組織和正常組織的基因組DNA, 分別標記后作為探針與正常人染色體雜交即可, 因而CGH最適合于檢測實體瘤, 淋巴瘤等不易得到高質量染色體標本的疾病. CGH另一無法替代的優點是, 它可在一次雜交中檢測整個基因遺傳 物質的增加或減少, 但精度有限, 對微小的擴增或缺失檢測不出, 僅適用于對整個基因組進行篩查. CGH也無法發 現平衡染色體易位.
從以上介紹可以看出: 各種FISH技術為白血病診斷提供了多樣的手段, 各種方法有其特定的適用范圍, 應根據 需要結合使用.
2. 預后估計, 治療監測和微小殘留病檢測;
白血病的預后估計, 治療監測和微小殘留病檢測都基于某種類型白血病特異的染色體或基因改變, 如對M3病 人首先檢測是否伴有t(15;17)/ PML-RARA或t(11;17)/PLZF/RARA, 如果有PML-RARA 融合基因則用全反式維甲酸 治療預后好, 而伴有PLZF/RARA則預后較差且需選擇其它治療方案. 初發時檢測出的異常可作為治療監測和隨訪 過程中檢測微小殘留病變的有效指標, 進行跟蹤監測. 在疾病初發和每次開始治療前檢測有否分子遺傳學異常非常 重要.
目前, 檢測手段主要依靠RT-PCR, 因為其敏感性高和易于開展, 但也常出現假陽性和假陰性問題, 影響了其準 確性, 并且無法量化. 近年來, 實時PCR很好地解決了量化的問題, 其缺點是成本較高, 探針種類有限, 目前僅能檢測 PML-RARA和AML1-ETO融合基因. 另一在國際上更為廣泛應用的方法是間期FISH. 間期FISH由于不需制備染色體 標本, 節省了大量時間, 又由于商品化探針質量可靠, 操作步驟簡單而達到快速, 簡便的要求. 間期FISH還具有可量 化和假陽性, 假陰性率低的優點, 且其敏感性僅比PCR方法略低, 完全符合臨床診斷的需要, 應用不同顏色的熒光探 針還可同時檢測多個基因異常.
綜上所述, FISH在血液病中的應用相當廣泛, 但在我國的血液病臨床上應用還不多. 由于FISH具有直觀, 敏感, 方便, 可量化和方法多樣, 適應不同檢測的目的等優點, 隨著FISH技術的發展, 成本的降低和探針種類和質量的進 一步提高, FISH必將成為血液病臨床及基礎研究的重要手段.
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