用溫度敏感型啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的基因
實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
1. 掌握將目的基因插入表達(dá)載體中表達(dá)目的蛋白的技術(shù)路線和試驗(yàn)流程。
2. 了解通過(guò)誘導(dǎo)重組DNA表達(dá)目的基因的技術(shù)。
實(shí)驗(yàn)原理
P L P R 啟動(dòng)子是大腸桿菌l噬菌體中控制早期轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，具有極強(qiáng)的起始RNA轉(zhuǎn)錄的功能，基因工程中常用它來(lái)構(gòu)建高效表達(dá)載體，它受抑制物CI蛋白的負(fù)調(diào)控。在實(shí)際中CI蛋白被改造成溫度敏感型(CIts)，由DNA片段CIts857（857bp長(zhǎng)）編碼。CIts在30℃時(shí)具有抑制啟動(dòng)子的活性，在42℃時(shí)失活而失去抑制啟動(dòng)子的活性，因此，改變工程菌的培養(yǎng)溫度即可控制目的基因的表達(dá)，這一點(diǎn)比用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)的系統(tǒng)要節(jié)省操作步驟和成本，在大規(guī)模基因表達(dá)中優(yōu)點(diǎn)尤其明顯。有些表達(dá)載體本身帶有CIts857片段，能自身編碼CIts蛋白，對(duì)宿主的選擇范圍較寬；另一些表達(dá)載體自身不帶CIts857片段，選擇宿主茵時(shí)，要求宿主是有缺陷的原噬菌體溶源化的菌株（如M5219)，前一類(lèi)載體表達(dá)效率往往更高。
將IL基因以5’端 Eco RI和3’端 Bam HI酶切位點(diǎn)插入pBV220載體多克隆位點(diǎn)中，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JMl03內(nèi)，便能通過(guò)溫度的變換控制CI蛋白的活性，繼而調(diào)節(jié)啟動(dòng)子的活性，使IL基因連同其5’端上游帶SD序列轉(zhuǎn)錄成mRNA并轉(zhuǎn)錄終止于rrnB位點(diǎn)，SD序列與ATG的間距為6bp，mRNA作為模板使核糖體高效翻譯出IL產(chǎn)物。
實(shí)驗(yàn)材料和試劑
（一）實(shí)驗(yàn)材料
1．載體：pBV220為中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所構(gòu)建。
2．質(zhì)粒pUCl8-IL。
3．大腸桿菌JMl03。
（二）培養(yǎng)基
l．LB液體培蕎基，LB固體培養(yǎng)基（同實(shí)驗(yàn)一）。
2．加氨芐青霉素（Amp）的LB固體培蕎基（同實(shí)驗(yàn)一）。
（三）試劑
1．酶類(lèi)： Eco RI、 Bam HI、T 4 DNA連接酶。
2．DNA回收試劑盒。
（四） 儀器
PCR自動(dòng)擴(kuò)增儀 微量移液器
離心機(jī) 電泳儀
水平電泳槽 透射紫外觀察儀
實(shí)驗(yàn)步驟
1．用 Eco RI和 Bam HI酶切pBV220（1mg）（酶切方法見(jiàn)實(shí)驗(yàn)四），pBV220經(jīng)純化后待用。
2．用 Eco RI和 Bam HI酶切pUCl8-IL DNA（4mg），酶切好的600bp IL DNA片段用DNA回收 試劑 盒回收待用。
3．取0.2mg酶切好的pBV220載體加0.2mg 的600bp IL DNA片段，用T4DNA連接酶連接（見(jiàn)實(shí)驗(yàn)五）。
4．取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JMl03感受態(tài)菌，涂布于加Amp的LB固體培養(yǎng)基上。
5．快速抽提質(zhì)粒；酶切鑒定重組質(zhì)粒。
6．用接種環(huán)取重組克隆于3ml 含50 mg/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基的150×15mm試管中，斜置于30℃恒溫?fù)u床，200r/min培養(yǎng)過(guò)夜。
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